Elfennau Trosglwyddadwy Dadreoleiddio RNA mewn Mutant KRAS(G12C) 3D Canser yr Ysgyfaint Sfferoidau
Oct 27, 2023
ABSENOLDEB
Mae Mutant KRAS yn rheoleiddio RNA elfen drawsgludadwy (TE) a mynegiant genynnau wedi'i ysgogi gan interfferon (ISG), ond mae'n parhau i fod yn aneglur a yw treigladau amrywiol yn KRAS yn effeithio ar wahanol RNAS TE trwy'r genom. Rydym yn dadansoddi'r transcriptomes o 3D canser yr ysgyfaint dynol spheroidau sy'n harbwr KRAS (G12C) treigladau i benderfynu ar y dirwedd o RNAs TE a reoleiddir gan mutant KRAS (G12C). Canfuom fod angen signalau KRAS (G12C) ar gyfer mynegiant RNAs TE sy'n deillio o LINE a LTR sy'n wahanol i RNAS TE y dangoswyd yn flaenorol eu bod yn cael eu rheoleiddio gan mutant KRAS (G12D) neu KRAS (G12V). At hynny, mae ataliad KRAS(G12C) yn benodol yn dadreoleiddio RNAs TE sy'n deillio o SINE o is-deulu Alu ieuengaf AluY. Mae ein canlyniadau yn datgelu bod dadreoleiddio RNA TE mewn celloedd canser yr ysgyfaint a yrrir gan KRAS yn dibynnu ar dreiglad, tra hefyd yn tynnu sylw at is-set o RNAs TE ifanc, sy'n deillio o Alu, sy'n cael eu hactifadu'n gydlynus â genynnau imiwnedd cynhenid ar ataliad KRAS (G12C).
Manteision cistanche tubulosa-Antitumor
RHAGARWEINIAD
Mae RNAS Elfennau Trosglwyddadwy (TE) yn cael eu dadreoleiddio'n rheolaidd yng nghyd-destun canser 1. Yng nghelloedd canser yr ysgyfaint mutant KRAS, mae genynnau bys sinc KRAB (KZNF) yn cael eu hisreoleiddio'n fras, gan arwain at ddadreoleiddio RNAS TE sy'n deillio o LINE, SINE, a afreolus. Elfennau LTR 2,3. Yn ogystal â RNAs TE, mae RNAs noncoding hir (lncRNAs) hefyd yn cael eu rheoleiddio'n gydlynus â genynnau signalau RAS 4, ac mae eu patrymau mynegiant yn cael eu newid yn yr un modd mewn llawer o ganserau 5-8. Ar gyfer RNAs TE, mae eu dadreoleiddio mewn canser yn achosi cyflwr o ddynwared firaol, gan arwain at actifadu genynnau imiwnedd cynhenid fel genynnau a ysgogir gan interfferon (ISGs) 3,9,10. Yn benodol, mae'r teulu Alu o SINEs yn brif ffynhonnell o RNAs TE imiwnogenig 11, sy'n cael eu hysgogi gan newidiadau epigenetig a achosir gan atalyddion DNA methyltransferase (DNMTi) neu ataliad KZNF mutant KRAS-mediated 3,9,10.
Er mwyn ymchwilio i sut mae mwtaniad cyffredin yn KRAS yn effeithio ar dirwedd RNA TE mewn celloedd canser yr ysgyfaint, fe wnaethom nodweddu trawsgrifiadau sfferoidau canser yr ysgyfaint 3D sy'n cadw mwtaniadau KRAS(G12C) ym mhresenoldeb neu absenoldeb atalydd mutant KRAS(G12C) 12. Rydym yn dangos bod angen signalau KRAS (G12C) ar gyfer mynegi RNAs TE sy'n deillio o LINE a LTR, tra bod ataliad KRAS (G12C) yn uwchreoleiddio'n benodol RNAs TE sy'n deillio o SINE ac is-set o enynnau sy'n gysylltiedig â interfferon (IFN). Mae ein canfyddiadau’n datgelu’r cydadwaith cymhleth rhwng signalau mutant KRAS a dadreoleiddio TE mewn celloedd canser yr ysgyfaint, lle mae set ddiffiniedig o elfennau AluY ifanc yn cael eu huwchreoleiddio mewn modd sy’n dibynnu ar dreiglad.
Manteision cistanche tubulosa-Antitumor
CANLYNIADAU
Mae ataliad KRAS(G12C) yn newid y trawsgrifiad codio a noncoding
Er mwyn pennu sut mae signalau oncogenig KRAS (G12C) yn rheoleiddio'r trawsgrifiad codio a noncoding, fe wnaethom berfformio dilyniannu RNA (RNA-seq) ar sfferoidau canser yr ysgyfaint 3D mutant KRAS (G12C). Ar gyfer RNA-seq, fe wnaethom ddefnyddio protocol hyd llawn gyda 5 'dynodwyr moleciwlaidd unigryw (UMIs) i alluogi cyfrif RNA manwl gywir wrth liniaru rhagfarnau chwyddo PCR 13 (Ffigur 1A). Gwnaethom gymharu trawsgrifiadau sfferoidau canser yr ysgyfaint H358 a gafodd eu trin â'r atalydd KRAS(G12C) ARS-1620 (ARS) i reoli sfferoidau (wedi'u trin gan DMSO) (Ffigur S1A) a gwelsom fod triniaeth ARS yn lleihau'n sylweddol lefelau ERK â ffosfforyleiddiad. (p-ERK) (Ffigur S1B), sy'n nodi bod triniaeth ARS yn atal signalau KRAS (G12C) i lawr yr afon. Gwelwyd tystiolaeth o atal signalau KRAS(G12C) trwy driniaeth ARS hefyd gan ostyngiadau ym maint sfferoid a hyfywedd celloedd (Ffigur S1C a S1D).
Ar y lefel RNA, fe wnaethom asesu digonedd cymharol gwahanol fioteipiau a superteuluoedd TE mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint 3D a gafodd eu trin gan ARS neu DMSO, a ddatgelodd newidiadau deinamig yng nghyfansoddiad RNA TE ar ataliad KRAS (G12C) (Ffigur 1B). Er i ni ganfod dim ond 32% o enynnau codio protein wedi'u hanodi gan GENCODE a 15% o enynnau lncRNA, roedd 92-96% o superfamilies TE (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) wedi'u cynrychioli yn ein tag UMI Data RNA-seq, sy'n datgelu dadreoleiddiad bras o RNAs TE yn y trawsgrifiad a yrrir gan KRAS(G12C). Roedd hyd at chwarter yr holl foleciwlau RNA a ganfuwyd mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint a driniwyd gan ARS yn deillio o TEs, sy'n dangos bod RNAs TE yn cynrychioli cyfran sylweddol o allbwn trawsgrifio celloedd canser yr ysgyfaint mutant KRAS (G12C).
manteision cistanche ar gyfer dynion-cryfhau system imiwnedd
Cliciwch yma i weld cynhyrchion Gwella Imiwnedd Cistanche
【Gofyn am fwy】 E-bost:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Fe wnaethom benderfynu nesaf ar y genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol iawn rhwng sfferoidau canser yr ysgyfaint 3D a driniwyd gan ARS a DMSO i nodi prosesau biolegol a oedd yn cael eu rheoleiddio gan signalau oncogenig KRAS (G12C). Cafodd sfferoidau canser yr ysgyfaint â signalau KRAS (G12C) cyfan eu cyfoethogi'n sylweddol ar gyfer genynnau sy'n ymwneud â man gwirio G2M, targedau E2F, targedau MYC, a gwerthyd mitotig (Ffigur 1C). Ar ôl ataliad KRAS(G12C), fodd bynnag, mynegodd sfferoidau canser yr ysgyfaint lefelau sylweddol uwch o enynnau sy'n ymwneud â ffosfforyleiddiad ocsidiad, cyflenwad, ac ymatebion alffa a gama IFN (Ffigur 1C), gan ddarparu tystiolaeth ategol bellach ar gyfer cynnwys signalau KRAS yn y rheoliad o enynnau sy'n gysylltiedig ag IFN 2,3.
Mae ataliad KRAS(G12C) yn gydgysylltiedig yn cymell ISGs ac elfennau AluY ifanc
Er mwyn egluro ymhellach y dadreoleiddiad cynhenid o ISGs ar ataliad KRAS(G12C), fe wnaethom nodi pa enynnau a TEs a fynegwyd yn sylweddol wahaniaethol ym mhob set genynnau a superfamily TE, yn y drefn honno. Ar draws genynnau ymateb gama IFN alpha ac IFN, y genyn a ysgogwyd gryfaf ar ataliad KRAS(G12C) mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint oedd RTP4 (Ffigur 2A), protein cludwr derbynnydd sy'n rheoleiddio signalau TBK1 yn negyddol 14. Yn ogystal, y cyfadeilad dosbarth I MHC genyn beta-2-microglobwlin (B2M), sy'n cael ei anactifadu dro ar ôl tro mewn canser yr ysgyfaint 15, hefyd wedi'i uwchreoleiddio'n sylweddol yn y ddwy set genynnau sy'n gysylltiedig ag IFN mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint a driniwyd gan ARS (Ffigur 2A).
O ystyried rôl uniongyrchol signalau KRAS oncogenig yn rheoliad RNA TE 3, fe wnaethom ymchwilio i ba is-deuluoedd o RNA TE oedd yn dibynnu ar mutant KRAS (G12C). Mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint â signalau KRAS(G12C) cyfan, canfuom fod is-deuluoedd LINE L1M6B a L1PA12 wedi'u mynegi'n fawr ac yn dibynnu ar KRAS (G12C), fel y dangosir gan eu dirywiad mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint a gafodd eu trin ag ARS (Ffigur 2B). At hynny, er mai dim ond un is-deulu DNA MER44D oedd yn dibynnu ar signalau KRAS(G12C), rheoleiddiwyd dros ddwsin o is-deuluoedd LTR gan mutant KRAS(G12C), gan gynnwys MLT1A{0-int, LTR51, MER5{0B , a LTR1B0 (Ffigur 2B). Mewn cyferbyniad, cafodd is-deuluoedd SINE i gyd eu huwchreoleiddio'n sylweddol ar ataliad KRAS (G12C) a'u hysgogi'n gydlynus â genynnau ISG penodol (Ffigur 2A) mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint. Roedd y RNAs SINE TE hyn i gyd yn deillio o is-deulu AluY (Ffigur 2B), sy'n dangos bod ataliad KRAS(G12C) yn dadreoleiddio is-set benodol o elfennau AluY ifanc.
Mae ataliad KRAS(G12C) yn is-reoleiddio RNAs digodio hir
Er mwyn egluro ymhellach effeithiau ataliad KRAS (G12C) ar y trawsgrifiad, archwiliwyd yr holl lncRNAs a fynegwyd yn sylweddol wahaniaethol mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint sy'n cael eu trin â rheolaeth ARS neu DMSO. Canfuom fod nifer fawr o lncRNAs yn dibynnu ar signalau KRAS (G12C) am eu mynegiant, gan fod llawer o'r lncRNAs hyn wedi'u hisreoleiddio'n sylweddol ar ataliad KRAS (G12C) (Ffigur 3A). Nid oes gan dri o'r lncRNAs hyn sydd wedi'u dadreoleiddio, AC114546.3, NCMAP-DT, ac AC073575.2, unrhyw swyddogaethau hysbys ond maent yn gorgyffwrdd mewn cyfeiriadedd antisense i'r genynnau codio ZNF770, RCAN3, ac ERP29, yn y drefn honno. Fel dosbarth o RNA heb godio, gwelsom is-reoleiddio eang o lncRNAs ar driniaeth ARS mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint (Ffigur 3B), gan nodi bod llawer o lncRNAs yn dibynnu ar signalau KRAS (G12C) am eu mynegiant.
manteision cistanche ar gyfer dynion-cryfhau system imiwnedd
TRAFODAETH
Yma rydym yn dangos bod angen signalau oncogenig KRAS(G12C) ar gyfer mynegi uwchdeuluoedd TE penodol, sef elfennau LINE a LTR, yn ogystal ag is-set o lncRNAs, gan ddangos ymhellach sut mae signalau RAS yn rheoleiddio'r trawsgrifiad noncoding 2-4. Fe wnaethom hefyd ddefnyddio model sfferoid canser yr ysgyfaint 3D ar gyfer ein harbrofion atalydd KRAS(G12C) oherwydd dangoswyd bod modelau 3D yn ailadrodd yr ymateb cyffuriau in vivo yn fwy ffyddlon o'u cymharu â modelau diwylliant 2D 16. Ymhellach, mae ein defnydd o UMI llawn yn seiliedig ar -hyd RNA-seq techneg 13 ein galluogi i ddal cyfansoddiad RNA TE a deinameg yn fwy cywir yn ein sfferoidau canser yr ysgyfaint drwy gael gwared ar PCR dyblyg yn ein data RNA-seq.
Mae ein canfyddiadau'n gyson ag astudiaethau blaenorol o ataliad KRAS(G12C), lle cafodd genynnau ymateb alffa a gama IFN eu huwchreoleiddio mewn celloedd canser yr ysgyfaint H358 a driniwyd gan ARS 17. Yn seiliedig ar briodweddau imiwnogenig hysbys RNAS sy'n deillio o Alu 11, mae ein canlyniadau'n awgrymu bod mae'r uwchreoleiddiad penodol o elfennau AluY ifanc ar ataliad KRAS(G12C) o leiaf yn rhannol gyfrifol am ddadreoleiddio cryf ISGs mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint sy'n cael eu trin gan ARS. Yn nodedig, nid yw cyfoethogi genynnau sy'n gysylltiedig ag IFN yn sylweddol mewn ymateb i driniaeth atalydd KRAS(G12C) yn cynnwys uwch-reoleiddio ISGs synhwyrydd RNA fel MDA-5, RIG-I, neu PKR, sy'n cael eu huwchreoleiddio i ddechrau. celloedd yr ysgyfaint mewn ymateb i signalau KRAS oncogenig 2,3.
Rydym wedi dangos yn flaenorol bod signalau mutant KRAS yn unig yn ddigon i gymell upregulation RNA TE mewn celloedd ysgyfaint dynol sydd wedi'u trawsnewid yn vitro 2,3, ac mae ein canlyniadau a ddisgrifir yma yn ymestyn yr arsylwadau hyn i gelloedd canser yr ysgyfaint gyda threiglad KRAS actifadu gwahanol. Mae treigladau KRAS(G12D) neu KRAS(G12V) ill dau yn cymell upregulation sylweddol yr is-deulu LTR12C mewn celloedd yr ysgyfaint wedi'u trawsnewid 3, ond ni welsom gyfoethogi sylweddol o RNAS TE sy'n deillio o LTR12C yn ein sfferoidau canser yr ysgyfaint KRAS (G12C). Yn lle hynny, gwelsom upregulation LTR51, LTR1B0, LTR14B, a LTR28B, gan awgrymu bod treigladau ennill-o-swyddogaeth amrywiol yn KRAS rheoleiddio gwahanol agweddau ar y trawsgrifiad RNA TE.
Mae ein gwaith yn darparu asesiad cynhwysfawr o sut mae trawsgrifiad RNA noncoding/TE RNA yn ymateb yn ddeinamig i ataliad KRAS(G12C). Gall astudiaethau yn y dyfodol roi mewnwelediadau newydd i rolau posibl RNAs noncoding/TE mewn mecanweithiau ymwrthedd atalyddion KRAS(G12C). Ar ben hynny, gall RNAs TE sy'n cael eu secretu o gelloedd canser ar ataliad KRAS wasanaethu fel biomarcwyr RNA allgellog 2,3,5,18,19 o ymateb a / neu wrthwynebiad i therapïau atalydd KRAS 20.
DEUNYDDIAU A DULLIAU
Llinellau cell
Cafodd llinellau celloedd canser yr ysgyfaint H358 sy'n cynnwys y mwtaniad KRAS(G12C) eu meithrin yn RPMI 1640 canolig (Invitrogen) wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10% (Sigma) ar 37 gradd, 5% CO2 mewn deorydd llaith. Profodd pob llinell gell yn negyddol am mycoplasma. Prynwyd llinellau cell o American Type Culture Collection (ATCC).
Profion hyfywedd celloedd
Ar gyfer profion hyfywedd sfferoid, cafodd 10,000 o gelloedd/ffynnon eu hadu mewn platiau ffynnon gwaelod crwn adlyniad isel a'u deor ar 37 gradd , 5% CO2 am 24 awr. Yna ychwanegwyd ARS- 1620 neu DMSO wedi'u gwanhau'n gyfresol at y celloedd, a chafodd platiau eu deor mewn amodau diwylliant safonol am 72 awr, gyda chyfryngau ARS a DMSO ffres yn cael eu disodli bob dydd. Mesurwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio pecyn Asesu Hyfywedd Celloedd Luminescent Cell Titer-Glo® (Promega) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Cafodd signal goleuedd samplau a gafodd eu trin gan ARS ei normaleiddio i reolaeth DMSO. Mesurwyd luminescence ar ddyfais foleciwlaidd SpectraMax iD3.
ynysu RNA
Cafodd cyfanswm RNA swmp ei ynysu o oddeutu 100 sfferoid H358 (fesul cyflwr) gan ddefnyddio pecyn Mini-Prep Quick-RNA (Zymogen) yn ôl protocol y gwneuthurwr. Cafodd RNA ei feintioli trwy NanoDrop-8000 Spectrophotometer.
Paratoi llyfrgell RNA-seq
Defnyddiwyd protocol Smart-seq3 13 wedi'i addasu i gynhyrchu llyfrgelloedd RNA-seq o gyfanswm RNA i gyfrif ac asesu moleciwlau RNA hyd llawn. Yn gryno, cafodd 10ng o gyfanswm RNA ei drawsgrifio o chwith gan ddefnyddio paent preimio oligoDT â chod bar (125nM) ac yna newid templed gyda switsh oligo templed â chod bar (125nM). Roedd y dilyniannau oligo hyn yn gweithio fel preimwyr ar gyfer ymhelaethu ar PCR. Defnyddiwyd pecyn Nextera HT (Illumina) i drosi llyfrgelloedd cDNA yn llyfrgelloedd dilyniannu gan ychwanegu paent preimio UMI-benodol i ymhelaethu ar y pennau cDNA sy'n cynnwys codau bar moleciwlaidd fel y disgrifir yn y protocol Smart-seq3. Aseswyd cDNA ac ansawdd y llyfrgell gan ddefnyddio sglodyn DNA bio-ddadansoddwr Agilent a'i fesur gan ddefnyddio'r assay DNA sensitifrwydd uchel ar y Qubit 3.0.
Blot gorllewinol
Cafodd tua 100 o sfferoidau H358 (fesul cyflwr) eu hynysu yn dilyn triniaeth ARS neu DMSO. Yna cafodd sfferoidau eu deor ar rew mewn byffer RIPA ynghyd ag atalydd proteas am 15 munud. Yna cafodd Lysates eu troelli am 10,000 RCF am 10 munud. Yna trosglwyddwyd Supernatant i diwb newydd ar gyfer paratoi sampl SDS-PAGE dilynol mewn byffer Laemmli, wedi'i ferwi am 5 munud ar 95 C am grynodiad terfynol o 1mg/ml. Perfformiwyd SDS PAGE i wahanu protein yn ôl maint ac yna'i drosglwyddo wedyn i bilen PVDF. Deorwyd pilenni â gwrthgyrff sylfaenol p-ERK (CST) a HSP90 (CST) dros nos ar 4 C. Yna deorwyd gwrthgyrff eilaidd (Abcam) ar bilenni wedi'u golchi TBST 3 gwaith mewn byffer blocio ar gyfer delweddu dilynol.
manteision cistanche ar gyfer dynion-cryfhau system imiwnedd
Diddymu GMU
Cafodd darlleniadau illumina pen pâr eu tocio gan ddefnyddio FastP 21 gyda gosodiadau diofyn. Cafodd UMIs eu tynnu o'r darlleniad a'u symud i'r enw darllen gan ddefnyddio teclyn umi_dyfyniad o'r pecyn UMI-tools 22 gyda'r patrwm cod bar wedi'i osod i "NNNNNNNN". Cafodd darlleniadau UMI a dynnwyd eu halinio yn erbyn HG38 gan ddefnyddio'r aliniwr STAR gyda'r set anodiadau GENCODE v38. Cafodd darlleniadau aliniedig eu dad-ddyblygu gan ddefnyddio "UMI-tools dedup" gyda gosodiadau diofyn.
Dadansoddiad RNA-seq
Cafodd pob ffeil fastq ei thocio â Trimmomatic 2 (0.38) 23 ac aseswyd y ffeiliau tocio canlyniadol gyda FastQC 24 ac yna eu prosesu gyda'r biblinell ddadansoddol ganlynol: Eog (1.3.0): ffug-alinio RNA -seq reads wedi'u perfformio gyda Salmon 25 gan ddefnyddio'r dadleuon canlynol: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --adennill Amddifad --rangeFactorizationBins 4 gan ddefnyddio mynegai a grëwyd o ffeil fasta transcriptome fersiwn GENCODE 35 gan ddefnyddio dilyniannau decoy i alluogi aliniad dethol. Crëwyd mynegai ychwanegol, sy'n ymwybodol o TE, mewn modd tebyg ond wedi'i ategu gan ddilyniannau a gynhyrchwyd o drac Repeat Masker UCSC. DESeq2 (1.32.0): Mewnforiwyd allbwn eogiaid i wrthrych DESeq gan ddefnyddio tximport 26 a pherfformiwyd dadansoddiad mynegiant gwahaniaethol gyda dadleuon safonol 27. Hidlwyd yr holl ganlyniadau i gael padj < 0.05. Lle defnyddiwyd data cyfrif, cafodd ei normaleiddio ar draws samplau gan ddefnyddio DESeq.
Dadansoddiad cyfoethogi set genynnau
Cafodd genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol eu rhestru yn ôl y gwerthoedd crebachu log2FoldChange a gynhyrchwyd gan DESeq2. Cafodd setiau genynnau eu caffael gan ddefnyddio'r pecyn R msigdbr (7.4.1) a'u hidlo i gynnwys setiau genynnau â statws 'Nodnod' yn unig. Defnyddiwyd y pecyn R fgsea (1.18.0) i gynhyrchu amcangyfrifon Cyfoethogi Set Genynnau a gafodd eu hidlo i ganlyniadau gyda pvalues wedi'u haddasu < 0.05.
CYFEIRIADAU
1. Burns, KH (2017). Elfennau trosglwyddadwy mewn canser. Nat Parch Cancr 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.
2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et al. (2020). Ailraglennu epigenomig o RNAS noncoding ailadroddus a genynnau wedi'u hysgogi gan IFN gan mutant KRAS. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.
3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L. ., et al. (2022). Mae Mutant KRAS yn rheoleiddio RNA elfen drawsgludadwy ac imiwnedd cynhenid trwy genynnau bysedd sinc KRAB. Adroddiadau Cell 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.
4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Canwr, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB, a Wold, BJ (2015). Mae dadansoddiad trawsgrifio un-gell yn datgelu newidiadau deinamig mewn mynegiant lncRNA yn ystod ailraglennu. Cell Bôn-gell 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.
5. Reggiardo, RE, Maroli, SV, a Kim, DH (2022). Biofarcwyr LncRNA o Llid a Chanser. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.
6. Schmitt, AC, a Chang, HY (2016). RNAS Digodio Hir mewn Llwybrau Canser. Cell Cancr 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010 .
7. Rinn, JL, a Chang, HY (2020). RNAS Noncoding Hir: Modaleddau Moleciwlaidd i Swyddogaethau Organig. Annu Parch Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biocemeg- 062917-012708.
8. Slack, FJ, a Chinnaiyan, AC (2019). Rôl RNAS Di-godio mewn Oncoleg. Cell 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.
9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. , Snyder, A., et al. (2015). Mae Atal Methylation DNA yn Achosi Ymateb Interferon mewn Canser trwy dsRNA Gan gynnwys Retrofeirysau Mewndarddol. Cell 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011 .
10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J., et al. (2015). Asiantau DNA-Dadmethylating yn Targedu Celloedd Canser Colorectol trwy Ysgogi Dynwared Feirysol trwy Drawsysgrifau Mewndarddol. Cell 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056 .
11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S. ., et al. (2020). Mae therapi epigenetig yn ysgogi trawsgrifio SINEs gwrthdro a dibyniaeth ADAR1. Natur 588, 169-173. 10.1038/s41586-020-2844-1.
12. Ostrem, JM, Peters, U.D., Sos, ML, Wells, JA, a Shokat, KM (2013). Mae atalyddion K-Ras (G12C) yn rheoli affinedd GTP a rhyngweithiadau effeithwyr yn allosteraidd. Natur 503, 548- 551. 10.1038/natur 12796.
13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR, a Sandberg, R. (2020). Cyfrif RNA un gell ar gydraniad alel ac isoform gan ddefnyddio Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10.1038/s41587-020- 0497-0.
14. Ef, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK, et al. (2020). Mae RTP4 yn atal ymateb IFN-I ac yn gwella malaria ymennydd arbrofol a niwropatholeg. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.
15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- Lopez, G., et al. (2017). Mae Proffil Genomig o Senografftiau sy'n Deillio o Gleifion ar gyfer Canser yr Ysgyfaint yn Adnabod Anweithredol B2M sy'n Amharu ar Imiwnyddiaeth. Canser Clin Cyf 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.
16. Sen, C., Freund, D., a Gomperts, BN (2022). Modelau tri dimensiwn o'r ysgyfaint: gorffennol, presennol a dyfodol: adolygiad bach. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., Dwyrain, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo, P., et al. (2022). Mae ataliad therapiwtig KRAS(G12C) yn ysgogi imiwnedd gwrth-tiwmor trwy gyfrwng interfferon mewn canserau imiwnogenaidd yr ysgyfaint. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.
18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U.D., a Kim, DH (2022). Llofnodion RNA allgellog o gelloedd adenocarcinoma ysgyfaint mutant KRAS(G12C). bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.
19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF, a Demirci, U. (2021). Tuag at Ynysu Ecsosomaidd Seiliedig ar Ficro-hylif a Chanfod ar gyfer Therapi Tiwmor. Nano Heddiw 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066 .
20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F., a Malek, S. (2021). Therapïau wedi'u targedu gan RAS. Nat Parch Drug Discov. 10.1038/s41573-021-00220-6.
21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., a Gu, J. (2018). fastp: rhagbrosesydd FASTQ popeth-mewn-un tra-gyflym. Biowybodeg 34, i884-i890. 10.1093/biowybodeg/bty560.
22. Smith, T., Heger, A., a Sudbery, I. (2017). Offer UMI: modelu gwallau dilyniannu mewn Dynodwyr Moleciwlaidd Unigryw i wella cywirdeb meintioli. Genom Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116 .
23. Bolger, AC, Lohse, M., ac Usadel, B. (2014). Trimmomatig: trimiwr hyblyg ar gyfer data dilyniant Illumina. Biowybodeg 30, 2114-2120. 10.1093/biowybodeg/btu170.
24. Brown, J., Pirrung, M., a McCue, LA (2017). Dangosfwrdd FQC: yn integreiddio canlyniadau FastQC i mewn i offeryn rheoli ansawdd FASTQ rhyngweithiol ac estynadwy ar y we. Biowybodeg. 10.1093/biowybodeg/btx373.
25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, a Kingsford, C. (2017). Mae eog yn darparu meintioliad cyflym a ymwybodol o fynegiad trawsgrifiad. Dulliau Nat 14, 417-419. 10.1038/nmeth.4197.
26. Soneson, C., Love, MI, a Robinson, MD (2015). Dadansoddiadau gwahaniaethol ar gyfer RNA-seq: mae amcangyfrifon ar lefel trawsgrifiad yn gwella casgliadau lefel genynnau. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000ymchwil.7563.2.
27. Love, MI, Huber, W., ac Anders, S. (2014). Amcangyfrif wedi'i gymedroli o newid plyg a gwasgariad ar gyfer data RNA-seq gyda DESeq2. Genom Biol 15, 550. 10.1186/s13059-014- 0550-8.
DIOLCHIADAU
Diolchwn i aelodau Kim Lab am drafodaethau defnyddiol. Cefnogwyd y gwaith hwn gan arian o Ysgol Beirianneg Baskin (i DHK). Cefnogwyd DC gan Ddyfarniad Cymrodoriaeth Rhagddoethurol gan y Rhaglen Ymchwil i Glefydau sy'n Gysylltiedig â Thybaco (T30DT0997), cefnogwyd RER gan Wobr Pontio Cymrawd Rhagddoethurol i Ôl-ddoethurol F99/K NIDDK KUH gan y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol (1F99DK00 {7}}), a chefnogwyd VP gan Ddyfarniad Cymrodoriaeth Rhagddoethurol gan y Rhaglen Ymchwil i Glefydau sy'n Gysylltiedig â Thybaco (T32DT4904).
CYFRANIADAU AWDUR
Ymchwil cysyniadol DHK, ymchwil a ddyluniwyd gan DC a DHK, perfformiodd DC, JL, a GM arbrofion, dadansoddi data RER a VP, ac ysgrifennodd DC a DHK y papur gyda mewnbwn gan yr awduron.
FFIGURAU
Ffigur 1. Mae ataliad KRAS(G12C) yn newid y trawsgrifiad codio a noncoding A. Sgematig arbrofol. B. Dosbarthiad cyfrifiadau a neilltuwyd i godio GENCODE, lncRNA, ac uwchdeuluoedd TE/ailadrodd mewn llyfrgelloedd RNA-seq sfferoid canser yr ysgyfaint a driniwyd gan ARS (Crs) neu DMSO-drin (dmso), lle mae pob colofn yn cynrychioli copi biolegol. C. Canlyniadau Dadansoddiad Cyfoethogi Set Genynnau Arwyddocaol a welwyd mewn sfferoidau canser yr ysgyfaint a driniwyd gan DMSO (ar y dde, NES positif) neu sfferoidau canser yr ysgyfaint wedi'u trin gan ARS (chwith, negyddol NES) gan ddefnyddio genynnau a fynegwyd yn wahaniaethol yn ôl sgôr cyfoethogi normaleiddio (NES).
Ffigur 2. Mae ataliad KRAS(G12C) yn cydgysylltu i gymell ISGs ac elfennau AluY ifanc
A. Lleiniau llosgfynydd sy'n darlunio mynegiant gwahaniaethol arwyddocaol a welwyd mewn setiau genynnau allweddol rhwng sfferoidau canser yr ysgyfaint a driniwyd gan DMSO (newid plyg dde, positif) neu sfferoidau canser yr ysgyfaint wedi'u trin gan ARS (chwith, newid plyg negyddol). B. Lleiniau llosgfynydd yn darlunio mynegiant gwahaniaethol arwyddocaol a welwyd mewn uwch-deuluoedd TE rhwng sfferoidau canser yr ysgyfaint a driniwyd gan DMSO (newid plygiad ar y dde) neu sfferoidau canser yr ysgyfaint a driniwyd gan ARS (chwith, newid plyg negyddol).
Ffigur 3. Mae ataliad KRAS(G12C) yn is-reoleiddio RNAs noncoding hir
A. Llain llosgfynydd o fynegiant gwahaniaethol sylweddol o GENCODE protein-codio RNAS a lncRNAs rhwng DMSO-drin (dde, cadarnhaol plyg-newid) neu ARS-drin (chwith, negyddol plygu-newid) canser yr ysgyfaint spheroids. B. Plot blwch o fynegiant gwahaniaethol sylweddol o GENCODE protein-codio RNAS a lncRNAs rhwng DMSO-drin (top, cadarnhaol plyg-newid) neu ARS-drin (gwaelod, negyddol plygu-newid) canser yr ysgyfaint spheroids (Wilcoxon).
FFIGUR ATODOL
Ffigur S1.
A. H358 3D sfferoidau canser yr ysgyfaint wedi'u trin ag ARS neu DMSO. B. Blot gorllewinol ar gyfer p-ERK a HSP90 gan ddefnyddio sfferoidau canser yr ysgyfaint H{358 3D wedi'u trin ag ARS neu DMSO. C. Mesuriadau diamedr (mewn micromedrau) (llain chwith) a hyfywedd celloedd (hyfywedd cell luminescent Cell Titer-Glo® mewn unedau fflworoleuedd cymharol) (llain dde) o sfferoidau canser yr ysgyfaint H358 3D wedi'u trin ag ARS neu DMSO ar ôl 3 neu 5 diwrnod o driniaeth (500 nM ARS-1620 neu DMSO). D. Mesuriadau diamedr (mewn micromedrau) o sfferoidau canser yr ysgyfaint H{358 3D wedi'u trin â chrynodiadau gwahanol o ARS-1620 (nM) am 7 diwrnod.
