Effeithiau Newydd Therapi Cyfuniad Trwy Atal Caspase-1/Pyroptosis Anwythol Gasdermin D mewn Nephritis Lupus

Am ragor o wybodaeth:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang a Jin Lin

ABSENOLDEB

Amcanion: Mae therapi cyfuniad â mycophenolate mofetil, tacrolimus, a steroidau yn effeithiol wrth gyflawni rhyddhad cyflawn mewnneffritis lupws(LN). Mae therapi cyfuniad wedi'i isreoleiddio'n unigryw-1 caspase o'i gymharu â monotherapies, sy'n gallu hollti gasdermin D (GSDMD) ac fe'i nodwyd yn ddiweddar fel ypyroptosisdienyddiwr. Fe wnaethom, felly, ymchwilio i weld a oedd therapi cyfuniad yn galluogi atal caspase-1/GSDMD-mediatedpyroptosisyn LN (neffritis lupws).

Cliciwch i cistanche deserticola ma ar gyfer neffritis

Dulliau: Canfuwyd mynegiant ac actifadu GSDMD mewn sbesimenau arennau o'r dynol a'r llygoden ag LN (neffritis lupws) defnyddio staenio imiwn-histocemegol ac imiwnoblotting. Cafodd podocytau cynradd wedi'u hynysu o lygod MRLlpr eu deor â LPS ac ATP a'u trin ymlaen llaw â monotherapi neu therapi cyfuniad. Atal caspase-1/GSDMD a achosirpyroptosisaseswyd trwy therapi cyfuniad mewn llygod MRLlpr a sbesimenau dynol. Cefais fy archwilio gan ddefnyddio pecyn caspase-1 FAM a sytometreg llif. Y cydberthynas rhwngpyroptosismewn gwaed ymylol a dadansoddwyd mynegai gweithgaredd clefyd lupus erythematosus systemig (SLEDAl).

Canlyniadau: Sbesimenau meinwe arennau o LN (neffritis lupws) dangosodd cleifion a llygod lefelau mynegiant llawer uwch a holltiad GSDMD. Mewn podocytau diwylliedig, roedd triniaeth gyfunol yn atal actifadu NLRP3 a caspase-1 yn sylweddol ac yn lleihau lefelau terfynell N GSDMD. Mae therapi cyfuniad yn atal dilyniant afiechyd trwy ataliad caspase-1/GSDMD-mediatedpyroptosismewn bodau dynol a llygod MRL/LPR. Roedd cydberthynas gadarnhaol rhwng niferoedd celloedd positif Caspase-1/PI mewn gwaed ymylol â SLE-DAl. LN (neffritis lupws) roedd cleifion â rhyddhad cyflawn a rhyddhad rhannol wedi lleihau niferoedd celloedd positif caspase-1/PI yn rhyfeddol o gymharu â'r llinell sylfaen. Fe wnaeth Ac-FLTD-CMK, atalydd sy'n deillio o GSDMD, atal datblygiad LN (neffritis lupws).

Casgliad: Roedd therapi cyfuniad yn atal caspase-1/GSDMD-mediatedpyroptosisin vitro ac in vivo a llai o ddatblygiad afiechyd.

Geiriau allweddol:neffritis lupws, pyroptosis, caspase-1, gasdermin D, therapi

Therapi triniaeth ar gyferpyroptosis

RHAGARWEINIAD

Nephritis lupus(LN) yw llid yr arennau sy'n deillio o ganlyniad i'r clefyd awtoimiwnedd lupus erythematosus systemig (SLE).LN (neffritis lupws) yn amlygiad mawr mewn cleifion sy'n dioddef o SLE. Mae tua 60 y cant o gleifion yn datblygu'r cyflwr hwn, gyda thua 20 y cant yn symud ymlaen i glefyd yr arennau cam olaf (ESRD)(1). Mae therapi cyfuniad â mycophenolate mofetil (MMF), atalyddion calcineurin (CNI), a steroidau yn cynhyrchu effeithiau cyflenwol a hefyd yn lleihau gwenwyndra (2). Argymhellir y therapi hwn fel y driniaeth gychwynnol ar gyfer LN (neffritis lupws) ac yn cynhyrchu gwell effeithiolrwydd a rhyddhad mwy cyflawn o gymharu â cyclophosphamide mewnwythiennol (IVCY) a steroidau (3-5).

Er mwyn ymchwilio i fecanweithiau moleciwlaidd a cellog therapi cyfuniad, defnyddiwyd dadansoddiad trawsgrifomig cynhwysfawr mewn model murine o LN (neffritis lupws). Roedd llygod MRL/LPR yn cael MMF, tacrolimus, neu prednisone yn unig fel monotherapi, neu gyfuniadau triphlyg o gyffuriau. Proffiliau mynegiant genynnau yn arennau llygod â LN (neffritis lupws)datgelodd fecanweithiau posibl a allai gyfrif am effeithiau adchwanegol a synergaidd therapi cyfunol o gymharu â monotherapïau. Un o 45 o enynnau wedi'u his-reoli sy'n cael eu modiwleiddio'n unigryw gan therapi cyfuniad yw caspase-1 (6). Mae'n cael ei actifadu gan inflammasomes, sef oligomers amlprotein sy'n cynnwys NLRP3, pro-caspase-1, a phrotein tebyg i brycheuyn sy'n gysylltiedig ag apoptosis (ASC), gyda pharth affinedd caspase integredig. Mae'r NLRP3/ASC/caspase-1 inflammasome wedi'i gydnabod fel cyfrannwr allweddol i bathogenesis LN (neffritis lupws). Mae'r inflammasome NLRP3 yn gyrru anhwylderau awtolidiol trwy actifadu caspase-1, gan gychwyn cynhyrchu cytocinau pro-llidiol ee IL-1 , y gwyddys ei fod yn sbarduno camweithrediad podocyt yn LN(7-9).

Mae caspase gweithredol-1 yn hollti gasdermin D(GSDMD) o fewn cyswllt ei barthau terfynell N-ac C. Yna, mae'r parth N-terminal yn hwyluso ffurfio mandwll yn y gellbilen, yn ysgogi cellpyroptosisa chynhyrchiad cytocin IL-1 ac IL-18(10). Mae astudiaethau sy'n dod i'r amlwg wedi dangos bod GSDMD-gyfryngupyroptosisyn cymryd rhan yn natblygiad clefydau gan gynnwys enseffalomyelitis awtoimiwn (11), sglerosis ymledol(12), hepatitis alcoholig(13), a chlefyd y coluddyn llid(14).Yn ogystal, mae ataliad genetig neu ffarmacolegol o caspase-1/GSDMD wedi dangoswyd ei fod yn amddiffyn yr arennau rhag anaf mewn modelau murine o glefyd diabetig yr arennau(15, 16) a hefyd ar ôl anaf acíwt i'r arennau(17-19). Fodd bynnag,pyroptosisyn LN (neffritis lupws)wedi'i ddiffinio'n wael hyd yma(20). Fe wnaethom ddamcaniaethu bod therapi cyfuniad yn rhoi effeithiau buddiol yn LN (neffritis lupws)) trwy atalpyroptosiswedi'i achosi gan caspase-1/GSDMD.

Yn yr astudiaeth bresennol, ymchwiliwyd i actifadu caspase-1 a GSDMD mewn meinweoedd arennau yn ogystal ag effeithiau therapi cyfuniad ar caspase-1/GSDMD-ddibynnolpyroptosisataliad mewn llygod MRL/LPR a chleifion â LN (neffritis lupws). Cydberthnasau posibl opyroptosisgyda mynegai gweithgaredd clefyd SLE (SLEDAI) ac aseswyd yr ymatebion triniaeth hefyd.

Triniaeth ar gyferpyroptosis

DEUNYDDIAU A DULLIAU

Astudio Poblogaeth

Roedd carfan yr astudiaeth yn cynnwys cleifion a gafodd ddiagnosis o fiopsi ag LN (lupwsneffritis) Llai na neu'n hafal i 6 mis cyn cofrestru. Ystod oedran y claf oedd 18-65 o flynyddoedd ac roedd pob un yn bodloni meini prawf dosbarthu Coleg Americanaidd Rhewmatoleg ar gyfer SLE (2l, 22) a'r Gymdeithas Ryngwladol Neffroleg/Cymdeithas Patholeg Arennol (2003). Recriwtiwyd cleifion o Ysgol Feddygaeth Prifysgol Zhejiang ac Ysgol Feddygaeth Prifysgol Nanjing a oedd â phroteinwria (Fwy na neu'n hafal i 1.5 g/d) a chrynodiadau creatinin serwm Llai na neu'n hafal i 265.2 umol/L. Roedd y meini prawf gwahardd yn cynnwys: roedd claf wedi cael ei drin yn flaenorol â dosau uchel o methylprednisolone; bioleg (yn targedu moleciwlau pathogenig penodol) neu therapi cyfuniad; plasmapheresis cyfredol neu driniaeth â globulin mewnwythiennol o fewn 12 wythnos i sgrinio; swyddogaethau afu annormal; heintiau gweithredol presennol; a thiwmor malaen o fewn 4 wythnos i ddechrau'r astudiaeth. LN (lupwsneffritis) cafodd cleifion therapi curiad y galon â methylprednisolone am 3 diwrnod ar ddogn o 0.5 g/d. Unwaith y cwblhawyd therapi pwls methylprednisolone, y grŵp cyfuniad â prednisone (0.6 mg/kg/d), MMF (0.5 g, dau ddos/d), a tacrolimus (2 mg, dau ddos/d) am gyfanswm o 4 wythnos. Yna cafodd y dosau o prednisone, a oedd yn dal i gael eu cyfuno â MMF(0.5 g, dau ddos/d) a tacrolimus (2 mg, dau ddos/d), eu lleihau 5 mg/d bob pythefnos hyd nes cyflawnwyd dos cynnal a chadw 1{0 mg/d(4). Cymerwyd rhyddhad cyflawn (CR) fel crynodiad protein wrinol 24-h Llai na neu'n hafal i 0.4 g, absenoldeb gwaddodion wrin gweithredol, crynodiad albwmin serwm Mwy na neu'n hafal i 35 g/L, a creatinin arferol (23). Cymerwyd rhyddhad rhannol (PR) fel gostyngiad o 50 y cant yn fwy na neu'n hafal i 24-h crynodiad protein wrinol i Llai na neu'n hafal i 3.5 g, crynodiad albwmin serwm o Fwy na neu'n hafal i 30 g/ L, a chynnydd arferol neu Llai na neu'n hafal i 25 y cant yn y crynodiad creatinin serwm o'r gwaelodlin. Cymeradwyodd ein Bwrdd Adolygu Sefydliadol yr astudiaeth (Rhif IIT20200410A) a rhoddodd pob claf ganiatâd ysgrifenedig cyn cofrestru.

Modelau Anifeiliaid

Cyflenwyd llygod benywaidd MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) gan y Labordy SLAC Animal Co. Ltd (Shanghai, Tsieina), rhannwyd pob llygod ar hap gyda chymorth generadur rhif ar hap, 5 llygod ym mhob grŵp a phob cawell. . Cawsant eu trin yn 8 wythnos oed ar lafar, gyda chyfuniad o 0.5 mg/kg tacrolimus (MCE HY-13756), 50 mg/kg MMF (MCE HY-B0199), ac 1 mg/ kg prednisone(MCE HY-B0214)neu gerbyd yn ddyddiol am gyfanswm o 8 wythnos fel y disgrifiwyd yn flaenorol(6). Cafodd Ac-FLTD-CMK ei syntheseiddio gan MCE a chwistrellwyd ip 10 mg/kg bob dydd. Daliwyd pob triniaeth i'r cyfranogwyr a oedd yn gyfrifol am y darganfyddiad canlynol. Penderfynwyd ar y gymhareb albwmin-i-creatinin wrin (UACR) gan ddefnyddio Albuwell M a'r Creatinine Companion (Excell, Phil, UD). Cafodd sbesimenau arennau eu gosod mewn paraformaldehyd 4 y cant cyn i staenio histolegol ac Imiwnohistocemegol a chortisau arennau gael eu tynnu i'w dadansoddi imiwnblotio. Cymeradwywyd y defnydd o lygod gan ein Pwyllgor Sefydliadol Gofal a Defnydd Anifeiliaid (Rhif2019-883).

Llygod ynysu Glomeruli a Diwylliant Podocyte

Cafodd Glomeruli eu puro o arennau 12-llygod benywaidd wythnos oed C57 a MRL/LPR fel y disgrifiwyd o'r blaen(24). Roedd llygod anesthetized yn cael eu darlifo â gleiniau magnetig 37 gradd C wedi'u cynhesu ymlaen llaw. Tynnwyd yr arennau a'u briwio ar rew yn 1 mm³. Yna cafodd y meinweoedd arennol eu treulio ar 37 gradd gyda cholagenase 1 mg/ml a 100 U/ml DNase I am 30 munud, yna eu hidlo ddwywaith gyda 100-μm hidlyddion cell Falcon (431752, BD). Ar ôl sawl golchiad gyda hydoddiant HBSS 4 gradd (H1025, Solarbio) a centrifugation ysgafn ar 200g am 5 munud, casglwyd glomeruli yn cynnwys gleiniau trwy ddefnyddio'r stand magnetig (HY-K0200, MCE) a'i olchi gyda hydoddiant HBSS dair gwaith. Cafodd glomeruli ynysig eu meithrin ar golagen math I (C3867, Sigma-Aldrich) seigiau diwylliedig wedi'u gorchuddio mewn 5 y cant CO, ar 37 gradd yn ôl y dull a ddisgrifiwyd gan Jeffrey (25). Defnyddiwyd podocytau rhan 2 yn yr arbrawf in-vitro.PyroptosisAnwythiad, Sytowenwyndra, a Canfod Cyfrinachedd IL-1

Cafodd podocytau o lygod MRL/LPR eu preimio gydag 1 mg/ml LPS (tell-pb5lps, In InvivoGen) wedi'i ddatrys yn Opti-MEM am 4 awr, ac yna ysgogiad ATP (tlrlatpl, In Vivo) 5mM. Cafodd podocytau o lygod C57 eu torri fel rheolaeth arferol. Roedd monotherapies tacrolimus (10μM), MMF (luM), a prednisone (10μM), neu therapi cyfun wedi'i ddeor ymlaen llaw gyda'r celloedd am 1 h cyn preimio LPS. Penderfynwyd ar y sytotocsigedd ar ôl ysgogiad trwy ddefnyddio pecyn canfod sytowenwyndra (11644793001, Roche) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Casglwyd yr uwchnatant ar ôl ysgogiad a'i fesur gan ddefnyddio'r llygoden IL{- ELISA Kit(BMS6002, Invitrogen) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

Gwrthgyrff ac Adweithyddion

Aseswyd lefelau Caspase-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.Pyroptosismewn gwaed ymylol yn cael ei fesur gan ddefnyddio FAM FLICAMCaspase-1 Kit(Bio-Rad, USA)yn ôl cytometreg llif.

Dadansoddiad Ystadegol

Perfformiwyd dadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio GraphPad Prism (vers. 8.0) a rhoddir y data fel modd ± SD. Cynhaliwyd dwy gymhariaeth grŵp gan ddefnyddio profion t Myfyrwyr a dadansoddiadau cydberthynas gan ddefnyddio cydberthynas Pearson. td dwy gynffon<0.05 was="" considered="" statistically="">

Triniaeth ar gyferpyroptosis ynneffritis lupws (LN)

CANLYNIADAU

GSDMD-CyfryngolPyroptosisYn cael ei actifadu yn yr Arennau y mae LN (lupwsneffritis)

Ymchwilio i weld a gyfrannodd GSDMD at bathogenesis LN (lupwsneffritis), gwnaethom brofi lefel mynegiant protein GSDMD yn gyntaf mewn sbesimenau arennau a gymerwyd o LN (lupwsneffritis) cleifion. Datgelodd dadansoddiad imiwnohistocemegol lefelau mynegiant hynod uwch o GSDMD mewn sbesimenau biopsi arennau a gymerwyd o LN (lupwsneffritis) cleifion â math IV, V, I ynghyd â Vand IV plws V, ac o gymharu â phynciau iach. Mynegwyd GSDMD yn gyffredinol mewn podocytes glomerwlaidd, celloedd tiwbaidd, a chelloedd interstitial ymdreiddio yn LN (lupwsneffritis) cleifion. Ehangwyd yr ardal â staenio positif (Saethau Coch) a staenio negyddol (Saethau Du) (Ffigur 1A). Yna amcangyfrifwyd canran yr ardal GSDMD-positif yn yr aren (Ffigur 1B). Cafwyd canlyniadau tebyg yn arennau llygod MRL/LPR a rheolyddion math gwyllt. Cadarnhaodd dadansoddiad imiwnoblotio fod mynegiant a holltiad GSDMD yn sylweddol uwch mewn sbesimenau arennau o lygod MRL/LPR (Ffigur 1C). Roedd y GSDMD mewn podocytes glomerwlaidd, celloedd tiwbaidd a chelloedd rhyngstitaidd ymdreiddiedig wedi'i ddyrchafu mewn llygod MRL/LPR o gymharu â llygod rheoli (Ffigur 1D). Roedd y data hyn yn awgrymu bod GSDMD-mediated wedi'i actifadu mewn meinwe arennol yr effeithiwyd arno gan LN (lupwsneffritis).

FFIGUR 1|Mae GSDMD wedi'i ddyrchafu'n gryf ac wedi'i hollti yn arennau cleifion a llygod yr effeithir arnynt gan LN (lupus neffritis).

(A) Staeniad imiwnocemegol o GSDMD mewn sbesimenau arennol a gymerwyd o bynciau iach a LN (lupwsneffritis) cleifion, staenio positif (Coch) a staenio negyddol (saethau Du).

(B) Dangosir meintioli ardaloedd positif GSDMD yn math III plws V, IV, IV plws V, V LN (lupwsneffritis) cleifion a phynciau iach.

(C) dadansoddiad Immunoblot o hyd llawn, hollti N-terminal parth a C-terminal parth GSDMD mewn cortecs arennol o dri phâr o reolaeth a MRL / LPR llygod.

(D) Staeniad imiwnocemegol o GSDMD mewn sbesimenau arennau a gymerwyd o reolaethau a llygod MRL/LPR.

*p < {{0}}.05,="" **p="">< 0.01.="" ln="">lupwsneffritis), lupwsneffritis; FL, llawn-hyd; NT, N-terminal parth; CT, C-terminal parth.

Mae Triniaeth Cyfuniad yn Atal GSDMD-GyfryngolPyroptosisYsgogi mewn Podocytes Cynradd In Vitro

Ymchwilio i effeithiau ataliol therapi cyfuniad arpyroptosis, gwnaethom gymhwyso'r dull ysgogi LPS plus ATP i gymellpyroptosismewn podocytau o lygod MRL/LPR, gan gymryd podocytau o lygod gwyllt math C57 fel y rheolaeth arferol. Cafodd podocytes o lygod MRLlpr eu preimio am 4h gyda LPS ac yna eu trin am 4h gydag ATP, ysgogiad a ddefnyddir yn gyffredin ar gyfer GSDMD-gyfryngolpyroptosisactifadu (26). O'i gymharu â rheolaeth arferol, dangosodd podocytau nodweddion morffolegol pyroptotig wedi hynny fel chwyddo celloedd a byrlymu. Fe wnaeth cyn-driniaeth gyda therapi cyfunol wella nodweddion morffolegol pyroptotig a sytowenwyndra yn sylweddol (Ffigur 2A). LPS ynghyd â sytotowenwyndra podocytau a achosir gan ATP. Yn debyg, fe wnaeth therapi cyfun leihau'n sylweddol y sytowenwyndra a'r secretiad IL-1 mewn uwchnatur a achosir gan ysgogiad LPS ac ATP (Ffigurau 2B, C). I wirio ymhellach gweithrediad GSDMD-mediatedpyroptosis, dadansoddwyd inflammasomes canonaidd ac actifadu GSDMD gan ddefnyddio immunoblotting. Yn gyson â newidiadau morffolegol pyroptotig a sytowenwyndra, mae LPS ac ATP wedi'i actifadu'n sylweddol NLRP3, caspase-1, ac wedi hollti GSDMD mewn podocytau (Ffigur 2D). Fe wnaeth triniaeth gyfuno atal actifadu NLRP3 a caspase-1 yn sylweddol a lleihau lefel terfynell N GSDMD. Yn nodedig, roedd monotherapies gyda tacrolimus, MMF, neu prednisone yn atal LPS ynghyd â sytowenwyndra celloedd ysgogol ATP a secretion L-1, ond dangosodd therapi cyfuniad effaith ataliol fwy arwyddocaol ar Caspase-1 a GSDMD. Darparodd y canlyniadau hyn dystiolaeth a oedd yn cefnogi'r farn bod triniaeth gyfunol yn lleddfu GSDMD-gyfryngolpyroptosistrwy atal actifadu NLRP3 a caspase-1.

FFIGUR 2|Mae triniaeth gyfuniad yn lleddfu pyroptosis mewn podocytes in vitro.

(A) Arddangoswyd nodweddion pyroptotig mewn podocytau cynradd diwylliedig ar ôl eu deor â LPS ynghyd ag ATP a'u trin ymlaen llaw â thriniaeth gyfuniad. Roedd saethau'n dangos bod celloedd yn arddangos nodweddion tebyg i byroptotig.

(B) Dadansoddwyd supernatants o gelloedd wedi'u herio ar gyfer marwolaeth celloedd, fel y'i mesurwyd gan secretion LDH.

(C) Dadansoddwyd goruchwylwyr o'r celloedd a heriwyd ar gyfer rhyddhau IL-1b.

(D) Dadansoddiad immunoblotting o NLRP3, caspase-1, GSDMD-NT, ac ASC mynegiant ar ôl tacrolimus, MMF, prednisone, neu driniaeth gyfuniad ar ôl NLRP3 activation inflammasome.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001;="" ****p="">< 0.0001.="" ldh,="" lactad="">

DSMO, Dimethyl sulfoxide, FK506, tacrolimus; MMF, mycophenolate mofetil; PNS, prednisone; COM, therapi cyfuniad; ASC, protein tebyg i brycheuyn sy'n gysylltiedig â apoptosis.

Triniaeth Cyfuniad Wedi'i Atal Caspase-1/GSDMD-AnwytholPyroptosismewn MRL/LPR Llygod

Rhoddwyd cyfuniad o MMF, tacrolimus, a prednisone neu reolaeth cerbyd i lygod MRL/LPR wyth wythnos oed. Yn gyson ag astudiaeth flaenorol (6), ar ôl triniaeth am 8 wythnos, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaeth mewn marwolaethau neu bwysau'r corff rhwng y grwpiau trin cerbyd a chyfuniad. Mewn cyferbyniad â'r grŵp cerbydau, roedd therapi cyfuniad yn effeithiol iawn wrth atal proteinwria, glomerwlosclerosis, ac ymdreiddiad celloedd imiwnedd rhyng-ranol arennol (Ffigur Atodol 1).

Nesaf, archwiliwyd lefelau mynegiant caspase-1 a GSDMD mewn therapi cyfuniad a grwpiau rheoli cerbydau. Datgelodd dadansoddiad imiwnohistocemegol fod mynegiant y caspase interstitial glomerwlaidd ac arennol-1 a GSDMD wedi gostwng yn sylweddol yn y grŵp therapi cyfuniad (Ffigur 3A). Canfu'r dadansoddiad imiwnblotio hefyd fynegiant a holltiad llai o caspase-1 a GSDMD yng nghorticau arennau'r grŵp triniaeth gyfunol (Ffigur 3B). Ar ben hynny, cyfrifwyd celloedd dwbl-positif caspase-1/propidium iodid (PI) gan ddefnyddio cytometreg llif apyroptosisPecyn-1FAM Caspase. Datgelodd y canlyniadau ostyngiad amlwg yn niferoedd celloedd gwaed ymylol caspase-1*/PI' mewn llygod MRL/LPR a gafodd y driniaeth gyfunol o gymharu â llygod MRL/LPR a gafodd eu trin â cherbyd. (Ffigurau 3C,D). Yn ogystal, roedd triniaeth gyfuniad hefyd yn lleihau'r crynodiad serwm Ii yn sylweddol (Ffigur 3E). Daethom i'r casgliad felly fod triniaeth gyfunol yn atal caspase-1/GSDMD-achosirpyroptosisyn yr arennau a chelloedd gwaed LN (lupwsneffritis) llygod.

FFIGUR 3|Triniaeth cyfuniad wedi'i wanhau caspase-1/pyroptosis wedi'i gyfryngu gan GSDMD mewn llygod MRL/LPR.

(A) Staeniad imiwnocemegol o GSDMD a caspase-1 mewn sbesimenau arennau llygod MRL/LPR. O'i gymharu â rheolaeth y cerbyd, roedd mynegiant caspase-1 a GSDMD yn amlwg yn y grŵp triniaeth gyfunol.

(B) Dadansoddiad immunoblot o GSDMD a caspase hyd llawn a hollt-1 mewn sbesimenau cortecs arennol llygod MRL/LPR; cymharu canlyniadau'r grwpiau trin cerbydau a chyfuniad.

(C) FACS o gelloedd caspase-1/PI dwbl-positif mewn gwaed ymylol o lygod MRL/LPR y rhoddwyd neu na roddwyd triniaeth gyfunol iddynt.

(D) Meintioli celloedd caspase-1/PI dwbl-positif yng ngwaed ymylol llygod MRL/LPR a roddwyd neu na roddwyd therapi cyfunol iddo.

(E) Meintioli crynodiadau serwm IL{{{0}}b mewn llygod MRL/LPR a roddwyd neu na roddwyd triniaeth gyfunol. ####P < 0.0001.="" facs,="" didoli="" celloedd="" a="" weithredir="" gan="" fflworoleuedd;="" ct,="" therapi="">

Therapi Cyfuniad Wedi'i Atal Caspase-1/GSDMD-AnwytholPyroptosisyn LN (lupwsneffritis) Cleifion

Rhwng Ionawr 2020 a Mehefin 2020, roedd 47 o gleifion ag LN (lupwsneffritis) wedi'u cofrestru a 43 wedi cwblhau 24-wythnos o therapi cyfunol. Rhestrir afiechyd sylfaenol a demograffeg y garfan gofrestredig yn Nhabl Atodol 1. Cynhaliwyd meintioli caspase-1/propidium ïodide (PI celloedd dwbl-positif mewn cleifion â LN (lupwsneffritis) math III, IV, V, III plws V, IV plws V ac mewn rheolyddion iach gan ddefnyddio apyroptosisFAM Caspase-1 cit a sytometreg llif. O'i gymharu â'r rheolaethau iach, cynyddwyd nifer y celloedd caspase-1/PI dwbl-bositif mewn gwaed ymylol (Ffigurau 4A, B). Fe wnaethom hefyd archwilio celloedd dwbl-bositif caspase-1/PI ar ôl 24-wythnosau o therapi ac ar y llinell sylfaen. Ar ôl 24-wythnos o therapi sefydlu, roedd nifer yr achosion o CR a PR yn 39.5 y cant (17/43) a 32.6 y cant (14/43), yn y drefn honno. Gostyngwyd niferoedd celloedd positif dwbl caspase-1/PI yng ngwaed ymylol cleifion CR a PR yn rhyfeddol o gymharu â gwaelodlin (Ffigur 4C). Fe wnaethom hefyd nodi cydberthynas rhwng caspase-1 a achosirpyroptosisa'r SLEDA; roedd y data yn dangos yn glir bod y gymhareb caspase-1/PI positif mewn gwaed ymylol yn cydberthyn yn bositif â SLEDAI (Ffigur 4D). Ac-FLTD-CMK, Atalydd sy'n Deillio GSDMD, Atal Datblygiad LN (lupwsneffritis).

FFIGUR 4|therapi cyfuniad wedi'i wanhau pyroptosis caspase mewn cleifion LN (lwpws neffritis).

(A) FACS o gelloedd dwbl-positif caspase-1/PI yng ngwaed ymylol LN (lupwsneffritis) cleifion sy'n cael eu trin â therapi cyfunol neu hebddo.

(B) Meintoli celloedd caspase-1/PI dwbl-positif mewn gwaed ymylol math III, IV, V, III plws V, a IV plws V LN (lupwsneffritis) cleifion a phynciau iach.

(C) Meintioli celloedd caspase-1/PI dwbl-positif yng ngwaed ymylol LN (lupwsneffritis) cleifion ar waelodlin, CR, Cysylltiadau Cyhoeddus, a pheidio â rhyddhau ar ôl therapi cyfuniad.

(D) Dadansoddiad cydberthynas o gymarebau celloedd dwbl-positif caspase-1/PI â SLE-DAI.

**p < 0.01.="" facs,="" didoli="" celloedd="" a="" weithredir="" gan="" fflworoleuedd;="" ln="">lupwsneffritis), lupwsneffritis; CR, rhyddhad llwyr; Cysylltiadau Cyhoeddus, rhyddhad rhannol; SLE-DAI, mynegai gweithgaredd clefyd lupus erythematosus systemig.

Canfu astudiaeth ddiweddar fod GSDMDhmice wedi datblygu mwy o ddyddodiad arennol C3 ac IgG, anaf arennol mwy difrifol, a marwolaethau uwch mewn model SLE a achosir gan imiquimod.17 Er mwyn egluro ymhellach rôl GSDMD mewn LN (lupwsneffritis), Cafodd llygod MRL/LPR eu trin ag Ac-FLTD-CMK21 gan ddechrau yn 8-wythnos oed, gyda'r cerbyd yn nodi'r rheolydd. Ar ôl 8-wythnosau o driniaeth, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaeth mewn marwolaethau neu bwysau'r corff rhwng y cerbyd a'r grŵp a gafodd ei drin ag Ac-FLTD-CMK. O'i gymharu â'r llygod rheoli cerbydau, roedd gan lygod MRL/LPR wedi'u trin ag Ac-FLTD-CMK gymhareb albwmin-creatinin wrin is (Ffigur 5A), crynodiad creatinin serwm is (Ffigur 5B), llai o glomerwlosclerosis (Ffigur 5C), a CD3 , CD4, a CD68 ymdreiddiad celloedd positif (Ffigur 5D). Roedd canlyniadau imiwnohistocemeg yn dangos mynegiant llai o GSDMD(Ffigur 5D) a secretiad serwm IL-1 wedi'i atal a bennwyd gan ELISA (Ffigur 5E). Gyda'i gilydd, roedd y data'n awgrymu bod Ac-FLTD-CMK yn atalpyroptosisyn yr arennau y mae LN yn effeithio arnynt (lupwsneffritis).

FFIGUR 5|Roedd Ac-FLTD-CMK, atalydd sy'n deillio o GSDMD, yn atal datblygiad LN (nephritis lupus).

(A) Cyfrifwyd y gymhareb albwmin-i-creatinin wrin mewn llygod MRL/LPR a roddwyd neu na roddwyd atalydd GSDMD iddo.

(B) creatinin serwm mewn llygod MRL/LPR a roddir neu na roddir atalydd GSDMD.

(C) Delweddau cynrychioliadol o sbesimenau arennau wedi'u staenio ag asid Cyfnodol-Schiff (PAS) a chanran glomerulosclerosis meintioli.

(D) Staeniad imiwnocemegol o CD3, CD4, F4/80, a GSDMD. (H) Meintioli crynodiadau serwm IL-1b mewn llygod MRL/LPR a roddwyd neu na roddwyd atalydd GSDMD iddo.

Dangosir data fel y cymedr ± SEM. #p < {{0}}.05,="" ##p=""><>

TRAFODAETH

Mae therapi cyfuniad yn strategaeth addawol oherwydd CR uwch a chyfraddau ymateb cyffredinol, amser byrrach i ryddhad, a llai o sgîl-effeithiau. Hyd yn hyn, nid oedd mecanweithiau moleciwlaidd sylfaenol therapi cyfuniad yn hysbys. Yn ddiweddar, bu Fu et al.(6) yn trin llygod MRL/LPR gyda monotherapi neu therapi cyfuniad a chynhaliodd ddadansoddiad trawsgrifomig cynhwysfawr o arennau cyfan. Yn ddiddorol, canfuwyd bod therapi cyfuniad ond nid monotherapies yn benodol ac yn unigryw yn atal mynegiant caspase-1.

Mae'r inflammasome NLRP3/ASC/caspase-1 bellach yn cael ei gydnabod fel cyfrannwr allweddol i bathogenesis LN (lupwsneffritis). Mae inflammasomes NLRP3 mewn podocytes yn cael eu actifadu mewn llygod sy'n dueddol o fod yn lupws a hefyd mewn cleifion â LN (lupwsneffritis). Pan gafodd inflammasomes NLRP3 eu hatal ag atalydd caspase-1, canfuwyd bod proteinwria, briwiau histolegol arennol, ac elifiad proses traed podocyt wedi'i leddfu mewn llygod sy'n dueddol o fod yn lupws(8). Roedd Huang et al. (27) adrodd bod NLRP3 wedi'i fynegi mewn celloedd tiwbaidd LN (lupwsneffritis) dosbarth IV a bod gweithrediad NLRP3 wedi'i gydberthyn yn gadarnhaol â'r sgôr mynegai gweithgaredd ar gyfer cleifion â LN. Profwyd bod Caspase-1 yn chwarae rhan hanfodol mewn lupws a chamweithrediad fasgwlaidd, ac felly mae'n darged posibl ar gyfer ymyriadau therapiwtig newydd(28). Roedd cyffuriau arbrofol sy'n dod i'r amlwg fel RIP3(29), antagonyddion derbynnydd P2X7 (30), atalyddion GSK -3 (31) ac agonist Nrf2 (32) yn atal datblygiad LN (lupwsneffritis) mewn llygod MRL/LPR trwy fodiwleiddio gweithgaredd inflammasome NLRP3/ASC/caspase-1, sy'n amlygu pwysigrwydd a difrifoldeb y NLRP3/ASC/caspase-1 inflammasome yn LN. Mae crynodiadau serwm uwch o IL-18 yn cydberthyn â difrifoldeb y clefyd a graddau'r anaf i'r arennau/cyfranogiad mewn cleifion SLE(33). Hyd eithaf ein gwybodaeth, mae'n ymddangos y gallai'r teulu gasdermin fod yn hanfodol ar gyfer datblygiadpyroptosis, ond bu prinder tystiolaeth o bresenoldeb GSDMD/GSDME mewn cleifion SLE.

Ar y cyfan, fe wnaethom archwilio gweithrediad a mynegiant GSDMD mewn sbesimenau biopsi arennau a gymerwyd o LN (lupwsneffritis) cleifion a llygod MRL/LPR. Roedd GSDMD wedi'i ysgogi'n gryf a'i hollti mewn podocytau glomerwlaidd a chelloedd tiwbaidd a chelloedd rhyng-raniadol ymdreiddio. Yn dilyn hynny, rhoddwyd cyfuniad o MMF, tacrolimus, a prednisone neu gerbyd i lygod MRL/LPR. O'i gymharu â'r grŵp rheoli cerbydau, lleihawyd gweithrediad caspase-1 a GSDMD yn y grŵp triniaeth gyfunol. Y radd opyroptosismewn gwaed ymylol hefyd yn llawer is mewn LN (lupwsneffritis) cleifion ar ôl rhoi therapi cyfunol. Ar ben hynny,pyroptosismewn gwaed ymylol ei gydberthynas gadarnhaol â SLEDAI, a oedd yn awgrymu hynnypyroptosismewn gwaed ymylol gallai fod yn arwydd arwyddocaol ar gyfer gweithgaredd SLE. Roeddem felly'n rhagdybio y gallai therapi cyfuniad roi effeithiau buddiol yn LN (lupwsneffritis) trwy atalpyroptosiswedi'i achosi gan caspase-1/GSDMD. Datgelodd astudiaethau adeileddol grisial blaenorol o caspase-1 mewn cyfadeilad ag Ac-FLTD-CMK lawer o ryngweithiadau ensymau-atalydd a oedd yn atal adnabyddiaeth GSDMD gan caspase-1. Fodd bynnag, canfuom fod Ac-FLTD-CMK, sy'n gweithredu fel atalydd sy'n deillio o GSDMD, yn atalpyroptosisyn LN (lupwsneffritis), a allai gael ei achosi gan fecanwaith gwahanol.

Yn ddiweddar, mewn model murine a ysgogwyd gan TLR o SLE(34), datblygodd GSDMD-/- llygod mwy o niwed i'r arennau a mwy o farwolaethau, a awgrymodd i ddechrau y byddai dileu GSDMD yn cael effaith amddiffynnol ac yn gysylltiedig â llid systemig a chynhyrchu awto-wrthgyrff gyda mwy o farwolaethau cysylltiedig. Mae llygod â diffyg GSDMD yn datblygu dyddodiad amlycach o gymhleth imiwnedd glomerwlaidd mewn sbesimenau arennau a phroteinwria uwch o gymharu â llygod math gwyllt. Canfuwyd secretion uwch o HMGB1 allgellog hefyd mewn GSDMD-/lymffocytau sy'n awgrymu bod necrosis/pyroptosisdigwydd pan oedd GSDMD yn absennol.

Sbardunau Caspase-1pyroptosistrwy holltiad GSDMD. Mewn cyferbyniad, mewn celloedd GSDMD-ddiffygiol neu GSDMD-isel, mae caspase-1 yn sbarduno apoptosis ac yna necrosis eilaidd sy'n ddibynnol ar GSDME apyroptosis. Pan fydd gweithgaredd GSDMD yn absennol ar ôl therapi, efallai y gallai GSDME hefyd newid caspase-3-apoptosis cyfryngol ipyroptosis(35,36).Yn ogystal, roedd actifadu caspase-8 yn llawer gwell mewn macroffagau a oedd yn ddiffygiol o ran GSDMD. Canfuwyd gweithrediad sylweddol caspase-8 hefyd yn LN a achosir gan GSDMD-ddiffygiol gan TLR (lupwsneffritis) llygod(34). Felly, yn absenoldeb GSDMD, mae'n debygol bod caspase-1 yn cydweithredu â caspase-8 i achosi caspase-3-GSDME-mediated apoptosis i newid ipyroptosisyn LN (lupwsneffritis), damcaniaeth sy'n gofyn am ymchwiliad arbrofol pellach.

Mae nifer o gyfyngiadau yn yr astudiaeth gyfredol. Yn gyntaf, yn seiliedig ar y data cyfredol, gwnaethom wirio y gallai therapi cyfuniad atalpyroptosis, ond gallai triniaethau eraill fel therapi deuol o steroidau a MMF, steroidau a tacrolimus, neu wrthgorff gwrth-CD20 hefyd gael effeithiau tebyg. Yn ail, nid yw union fecanwaith moleciwlaidd effaith atal therapi cyfuniad ar caspase-1 wedi'i archwilio'n dda. Yn olaf ond nid lleiaf, rydym yn arsylwi ar berthynas celloedd dwbl-bositif caspase-1/PI mewn gwaed ymylol â SLE-DAI a'r newid cyn ac ar ôl triniaeth therapi cyfuniad mewn LN ôl-weithredol (lupwsneffritis) carfan cleifion. Mae angen ymchwilio ymhellach i werth rhagfynegol clinigol celloedd caspase-1/PI ar gyfer gweithgarwch clefydau ac ymateb i driniaeth mewn carfan fwy o faint.

Ar y cyfan, fe wnaethom nodi bod therapi cyfunol yn rhoi ei effeithiau buddiol trwy atal caspase-1/GSDMD a achosirpyroptosisyn LN (lupwsneffritis), a roddodd fewnwelediad newydd i'r mecanweithiau cellog dan sylw. Yn wir, roedd therapi cyfuniad yn atal mynegiant caspase-1 yn benodol ac yn unigryw. Roedd ataliad ffarmacolegol neu enetig o NLRP3 a caspase-1 yn gwella swyddogaeth arennol ac yn atal hunanimiwnedd yn LN (lupwsneffritis). Rôl pathoffisiolegol caspase-1 yn LN (lupwsneffritis) yn deilwng o astudiaeth bellach, a therapïau sy'n targedu GSDMD mewn cleifion ag LN (lupwsneffritis) angen eu gwerthuso'n ofalus iawn.

Dull triniaeth ar gyferpyroptosis

CYFEIRIADAU

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.LwpwsNephritis: Diweddariad Cyfredol.Arthritis Res Ther (2011) 13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. Mae Y, Zhang H, Liu Z. Unigolynu Therapi ynLwpwsNephritis. Cynrychiolydd Int Arennau (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS.Triniaeth Llwyddiannus o Ddosbarth V ynghyd â IVLwpwsNephritisGyda Therapi Amldarged. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al.Multitarget Therapi ar gyfer Triniaeth SefydluLwpwsNephritis: Treial ar Hap, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al.Multitarget Therapi ar gyfer Triniaeth Cynnal a Chadw oLwpwsNephritis. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al.Transcriptomic Analysis Yn Datgelu Mecanweithiau Synergaidd Newydd mewn Therapi Cyfuno ar gyferLwpwsNephritis. Arennau Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Ummarino D.LwpwsNephritis: NLRP3 Inflammasome Ignites Podocyte Camweithrediad. Nat Parch Rheumatol(2017) 13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9