TUNEL Assay: Offeryn Pwerus Ar gyfer Gwerthuso Anafiadau Arennau

Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Crynodeb:Mae assay deoxynucleotidyl transferase terminal dUTP labelu llysenw (TUNEL) yn assay hirsefydlog a ddefnyddir i ganfod darniad DNA sy'n gysylltiedig â marwolaeth celloedd (termini DNA 3'-OH) gan endonucleasau. Oherwydd bod yr ensymau hyn yn arbennig o weithgar yn yr aren, mae TUNEL yn cael ei ddefnyddio'n helaeth i nodi a meintioli darniad DNA a marwolaeth celloedd mewn rhai diwylliedig.aren celloedd ac arennau anifeiliaid a dynol sy'n deillio o'ranaf gwenwynig neu hypocsig. Mae nodweddiad cynnar TUNEL fel assay apoptotig wedi arwain at nifer o gamddehongliadau o fecanweithiaucell arennau anaf.Serch hynny, TUNEL yn dod yn fwyfwy poblogaidd ar gyferanaf i'r arennauasesiad oherwydd gellir ei ddefnyddio'n gyffredinol mewn celloedd meithrin a meinwe ac ar gyfer pob mecanwaith marwolaeth celloedd. Ar ben hynny, mae'n sensitif, yn gywir, yn feintiol, yn hawdd ei gysylltu â chelloedd neu adrannau meinwe penodol, a gellir ei gyfuno ag imiwn-histocemeg i ganiatáu adnabyddiaeth ddibynadwy o fathau o gelloedd neu fecanweithiau tebygol o farwolaeth celloedd. Yn draddodiadol, mae dadansoddiad TUNEL wedi'i gyfyngu i bresenoldeb neu absenoldeb signal TUNEL. Fodd bynnag, gellir cael gwybodaeth ychwanegol am fecanwaith marwolaeth celloedd o'r dadansoddiad o batrymau TUNEL.

triniaeth anhwylder yr arennau cyffroi rhywiol gyda phowdr atodol cistanche

Rhagymadrodd DNA yw'r unig foleciwl yn y gell y gellir ei atgyweirio, ond ni ellir ei ailsyntheseiddio'n llwyr ar ôl difrod. Dinistrio DNA yw un o gamau olaf proses marwolaeth celloedd aml-gam, y gellir ei wrthdroi o bosibl hyd at ddarnio DNA terfynol. Felly, mae'r olaf yn nodwedd gyffredin a marciwr mecanistig o farwolaeth celloedd anadferadwy [1,2]. Mae darnio DNA sy'n gysylltiedig â marwolaeth celloedd fel arfer yn cael ei "ddelweddu" gan assay labelu terfynell deoxynucleotidyl transferase dUTP (TUNEL), ysgol DNA, neu assay comed [3]. Mae electrofforesis maes pwls [4] ac assay synthesis oligonucleotide-primed ar hap (ROPS) [5] yn ddau asesiad eilaidd arall a ddefnyddir yn anaml. Mae'r defnydd o assay comet wedi'i gyfyngu i in vitro (celloedd diwylliedig) yn unig, ac mae ei feintoli yn llafurddwys [6]. Mae'n bosibl cynnal profion comed mewn niwclysau celloedd ynysig, ond mae'n gysylltiedig â ffactorau dryslyd ychwanegol yn ystod ynysu niwclysau. Nid yw'r ail, assay ysgolio DNA, yn ddull meintiol, a chafodd y gobaith cychwynnol y byddai patrwm yr ysgol yn erbyn ceg y groth yn gwahaniaethu rhwng apoptosis a necrosis, yn y drefn honno, ei chwalu gan y profodd y dull hwn i fod yn annibynadwy [7]. O'r tri phrif ddull, TUNEL yw'r mwyaf sensitif, sy'n cymryd lleiaf o amser, a mwyaf cymwys yn gyffredinol. Gellir ei ddefnyddio mewn celloedd a meinweoedd diwylliedig ac ar gyfer pob mecanwaith marwolaeth celloedd. Mae'n gywir, yn feintiol, wedi'i gysylltu'n hawdd â chelloedd neu adrannau meinwe penodol, a gellir ei gyfuno ag immunohistochemistry i ganiatáu adnabod yn ddibynadwy y mathau o gelloedd neu fecanweithiau anaf celloedd sy'n gysylltiedig â signalau TUNEL-positif [2].

Mae toriadau DNA y gellir eu mesur gan TUNEL yn cael eu cynhyrchu'n bennaf gan endonucleasau apoptotig. Yr endonucleases mwyaf gweithredol yn yr aren yw deoxyribonuclease 1 (DNase I) ac endonuclease G (EndoG) [8-10]. DNase Fi yw'r endonuclease apoptotig mwyaf gweithgar a niferus mewn mamaliaid [11]. Mae'r aren, y chwarennau poer, y pancreas, a'r coluddyn yn organau y gwyddys eu bod yn cynhyrchu symiau uchel o DNase I. Mae celloedd epithelial mewn chwarennau poer, pancreas, a'r coluddyn yn secrete DNase I fel ensym treulio yn y llwybr bwyd anifeiliaid. Mae rhai cellog DNase I yn ymladd yn erbyn "tramor" DNA goresgynnol celloedd cynnal [12]. Mae DNase I nad yw'n gyfrinachol yn cyflwyno perygl cudd i DNA celloedd gwesteiwr, ond fel arfer nid yw DNases yn gweithredu ar DNA celloedd gwesteiwr tan anaf neu farwolaeth y gell. Yn yr aren, mae DNase I yn cael ei secretu gan gelloedd epithelial tiwbaidd, yn ôl pob tebyg i ddinistrio firysau a bacteria yn yr wrin. Mae'r swyddogaeth hon yn debygol o ddigwydd ar y cyd â phroteinasau, yn arbennig, meprin, sef y prif broteinas mewn wrin [13]. Er ei fod yn amddiffyn rhag haint, mae presenoldeb DNase hynod weithgar yn yr aren yn gwneud yr organ hwn yn agored i anaf, lle gwyddys bod gweithgaredd DNase yn sytotocsig i gelloedd lletyol. Mae DNases yn hyrwyddo marwolaeth celloedd a achosir gan ysgogiadau gwenwynig neu hypocsig ac yn dinistrio'r holl gelloedd DNA arennau gwesteiwr a ryddhawyd o ganlyniad i farwolaeth celloedd.

Arennauyn organau hidlo sy'n tynnu cyfansoddion gwenwynig o'r corff. Mae gweithgarwch DNAnase I uchel mewn arennau yn gwneud celloedd yr arennau'n sensitif iawn i anafiadau o gyfansoddion gwenwynig a'u cynhyrchion metabolig. Mae hyn yn golygu mai TUNEL yw'r dull mwyaf priodol a chymwys i fesur anaf i'r aren. Yn yr adolygiad hwn, byddwn yn canolbwyntio ar TUNEL fel assay a ddefnyddir yn eang, addysgiadol a manwl gywir ar gyfer mesur marwolaeth celloedd ac anafiadau meinwe yn yr aren. Byddwn yn trafod agweddau ar TUNEL fel y mae'n berthnasol i glefydau ac anafiadau arennau ac yn nodi rhinweddau, technegau, a nodweddion TUNEL nad ydynt yn cael eu defnyddio'n ddigonol i hyrwyddo defnydd cynhyrchiol a phriodol o'r assay pwerus hwn mewn ymchwil, diagnosteg, a therapi clefydau'r arennau. Byddwn hefyd yn trafod patrymau delwedd TUNEL amrywiol y gellir eu cysylltu â mecanweithiau marwolaeth celloedd. Mae'r pwyntiau a godwyd yn yr adolygiad hwn yn berthnasol yn fras i ddefnydd TUNEL mewn organau heblaw'r aren.

Geiriau allweddol:TUNEL; marwolaeth celloedd; aren; DNases; endonucleases; anaf meinwe

Egwyddorion TUNELDatblygwyd assay TUNEL ym 1992 gan Gorczyca et al. [14] a Gavrieli et al. [15], gan ddefnyddio labelu fluorochrome ac avidin-peroxidase, yn y drefn honno. Bryd hynny, roedd dirfawr angen dulliau newydd o asesu apoptosis, a llwyddodd TUNEL i lenwi'r bwlch hwn. Wedi'i farchnata i ddechrau fel assay ar gyfer toriadau llinyn DNA yn ystod neu'n gysylltiedig ag apoptosis [14,16], yn absenoldeb profion gwell, daeth TUNEL yn gyflym yn assay safonol ar gyfer apoptosis [17,18]. Fodd bynnag, cydnabuwyd bron yn syth gan ymchwilwyr bod TUNEL yn mesur unrhyw ddarniad DNA yn ddiwahân, nid dim ond yr un sy'n gysylltiedig ag apoptosis [19-21]. Serch hynny, roedd yr angen am brofion apoptotig mor fawr fel bod yr adroddiadau prin bod TUNEL yn amhenodol ar gyfer apoptosis yn cael eu hanwybyddu'n gyffredinol. Arweiniodd hyn at lawer iawn o adroddiadau ffug-bositif o apoptosis yn yr aren ac organau eraill, i'r graddau yr adroddwyd hyd at 20 y cant o gyfanswm y celloedd yn apoptotig hyd yn oed heb anaf [22-25] pan fydd newidiadau fel gallai bach fel 0.01 y cant fod yn dystiolaeth ystadegol arwyddocaol o anaf i feinwe.

Mae assay TUNEL wedi profi dadeni yn ystod y blynyddoedd diwethaf ers diwedd y ffyniant mewn astudiaethau apoptosis ychydig flynyddoedd yn ôl. Cynhyrchodd ein chwiliad PubMed o erthyglau cyfnodolion yn cynnwys termau "arennau" a "TUNEL" dros 1500 o ganlyniadau rhwng 1992 a 2020. Yn 2019, cyhoeddwyd 170 o erthyglau, y nifer uchaf mewn un flwyddyn dros y 28 mlynedd diwethaf (Ffigur S1) ac sydd yn ffurfio mwyafrif yr erthyglau a arolygwyd ar gyfer yr adolygiad hwn. Defnyddiodd nifer o astudiaethau positifrwydd TUNEL fel mesur cyffredinol o farwolaeth celloedd sy'n gysylltiedig â darnio DNA mewn mathau eraill o farwolaethau celloedd ar wahân i apoptosis. Er enghraifft, mae TUNEL yn gallu canfod ferroptosis, ffurf sydd newydd ei ddarganfod o farwolaeth celloedd anapoptotig wedi'i raglennu a ysgogir gan ddifrod ocsideiddiol sy'n digwydd yn ystod isgemia arennol (IR) mewn llygod [26]. Dangosir bod pyroptosis, sy'n ffurf llidiol o farwolaeth celloedd wedi'i raglennu sy'n wahanol i apoptosis a necrosis, yn gysylltiedig â signalau TUNEL-positif [27,28]. Gwelwyd TUNEL-positifrwydd yn ystod necroptosis a gyfrannodd at ddisbyddu cynyddol celloedd tiwbyn arennol mewn llygod mawr a oedd yn destun neffrectomi is-gyfanswm [29]. Yn yr arennau a meinweoedd eraill, mae signalau TUNEL positif wedi'u canfod mewn necrosis [30,31], awtoffagi wedi'i ddadreoleiddio [32-35], anoikis [36,37], trychineb mitotig [35,38], awtolysis [39], Pautolysis [39], proptosis [40], ac aponeurosis [30], gan ddangos TUNEL i fod yn assay gwirioneddol gyffredinol ar gyfer marwolaeth celloedd anghildroadwy.

Mae'r assay TUNEL yn seiliedig ar labelu pennau 3'OH gan ensym DNA pen-benodol 3'OH, terfynell deoxynucleotidyl transferase (TdT) (Ffigur). Gall defnyddio DNA polymeras neu ddarn Klenow DNA polymeras yn lle TdT helpu i benderfynu ar y math o bennau 3'OH (llys, bylchau, neu oligos sy'n crogi drosodd) oherwydd bod angen templed ar bolymerasau DNA (y llinyn DNA gyferbyn) ac felly ni fyddant yn labelu hongian neu ymwthio allan pennau DNA. Mae'n bwysig cofio nad yw cynhyrchu pennau DNA 3ZOH yn unigryw i endonucleases apoptotig (DNA-ddiraddiol). Mae pennau DNA 3'OH yn signal "cyfathrebwr" mawr, sy'n enwadur cyffredin o'r mwyafrif o ensymau DNA. Maent yn cael eu cynhyrchu a'u defnyddio gan bron pob ensymau DNA mewn ewcaryotau, gan gynnwys endonucleases atgyweirio DNA (apurinic/apyrimidinic, AP), ecswniwcleasau, polymerasau DNA, ligasau DNA, trosglwyddiadau DNA, a topoisomerases. Yn ogystal, gellir trosi cyfuniadau 3'Id 3z-siwgr, neu 3z-protein i derfynau 3'OH gan ffosffatasau, glycosylasau, a phroteinasau, yn y drefn honno. Dyna pam mae angen dealltwriaeth fanwl o'r hyn sy'n cael ei fesur er mwyn cymhwyso TUNEL yn llwyddiannus a dehongli ei ganlyniadau.

O'i gymharu â dau ddull sylfaenol arall o fesur darnio DNA, ysgol DNA a assay comet, mae gan TUNEL y fantais o fod yn seiliedig ar adnabod termini DNA yn hytrach na darnau (Ffigur 2). Yn ddamcaniaethol, byddai TUNEL yn debygol o fod yn fwy sensitif a llinol ar gyfer nodi darniad DNA cychwynnol (isel) nag ysgol DNA neu gomed, y mae gan y ddau ohonynt gyfnod o oedi wrth gronni darnau bach o symudedd uchel. Beth bynnag, mae gan astudiaethau sy'n cyfuno TUNEL â naill ai gomed ) 41,42] neu ysgol DNA [43,44] rywfaint o fantais o ddal darnio DNA cynnar gyda'r sensitifrwydd mwyaf posibl.

Ceisiadau TUNELDefnyddir TUNEL i nodi a mesur anafiadau i'r arennau mewn astudiaethau tocsi golegol clinigol a sylfaenol mewn ystod amrywiol o gymwysiadau, gan gynnwys triniaethau meddygol [45], amgylcheddol [46], datguddiadau amaethyddol [41] a diwydiannol [47], ac anifeiliaid [48] ] a gwyddorau bwyd [49]. Mae TUNEL yn berthnasol i bob math o gell, organ, a rhywogaeth sydd â DNA a DNases, sy'n cynnwys bron pob rhywogaeth. Mae TUNEL wedi'i ddefnyddio i nodi a mesur anafiadau i'r arennau mewn amrywiaeth eang o anifeiliaid, gan gynnwys pysgod sebra [50], pysgod reis Japaneaidd [51], ieir [48], gerbils [52], llygod [41], llygod mawr [45], rabb ei [53], mini-moch [54], a bodau dynol [55]. Mantais bwysig TUNEL yw y gellir ei ddefnyddio mewn celloedd diwylliedig sefydlog yn ogystal â meinweoedd sefydlog. Mae hyn yn darparu cysondeb methodolegol ar gyfer cymharu canlyniadau in vitro ac in vivo mewn astudiaethau lle gellir ymchwilio i fecanweithiau mewn celloedd arennau meithrin, tra bod goblygiadau in vivo yn cael eu hasesu yn arennau'r anifeiliaid. Gellir defnyddio unrhyw beth rhwng celloedd cyfan a meinweoedd hefyd, gan gynnwys sfferoidau celloedd diwylliedig [56] a sleisys arennau ex vivo [57,58].

Gall dwyster TUNEL o ran cryfder y signal neu nifer y celloedd TUNEL-positif amrywio rhwng rhywogaethau yn dibynnu ar actifedd DNases. Yn ein profiad ni, mae gan aren llygod mawr DNase I yn fwy gweithgar nag aren llygoden, ac mae cryfder signal TUNEL-positif yn cyd-fynd â hyn. Pan gymharir yr aren ag organau eraill, mae ei signal TUNEL-positif yn ddwys iawn ac yn debyg i organau eraill â gweithgaredd DNase I uchel, megis y coluddyn a'r chwarren salivary. Ar ben arall y sbectrwm, gwelir y cryfder signal TUNEL-positif isaf yng nghelloedd yr ymennydd a thiwmor / canser, lle mae mynegiant DNase I yn fwyaf tebygol o gael ei anactifadu gan splicing amgen yn y rhanbarth codio [59]. Gwelir signal TUNEL-positif ym mhob math o gelloedd yn yr aren. Ar gyfartaledd, mae'r epitheliwm tiwbaidd yn cael ei niweidio'n amlach na glomeruli, yn enwedig mewn anafiadau acíwt (Ffigur 3A). Mae hyn yn cydberthyn yn dda â'r gweithgaredd DNase I sy'n bodoli yn y mathau hyn o gelloedd. A barnu o wahaniaethau rhyw ac oedran a welwyd yn ein harbrofion, mae DNase I yn fwy niferus a gweithgar mewn gwrywod na benywod ac anifeiliaid canol oed o gymharu ag anifeiliaid hen neu newydd-anedig. Fodd bynnag, nid oes unrhyw wahaniaeth amlwg mewn TUNEL-positifrwydd yn amlwg mewn perthynas â rhyw neu oedran, yn ôl pob tebyg oherwydd y amlwg neu ei fod yn bennaf gan ffactorau eraill. Mewn rhai modelau arennau (fel isgemia-reperfusion), mae DNase I yn cael ei gymell [9]; tra mewn eraill, nid yw ac efallai y bydd hyd yn oed yn cael ei atal (er enghraifft, mewn gwenwyndra cisplatin) [10]. Dangoswyd bod actifadu endonucleases, os yw'n bresennol, yn digwydd o fewn y 24 awr cyntaf ar ôl anaf i'r arennau [9,60,61]. Felly, nid oedd yn syndod bod o leiaf hanner y cymwysiadau TUNEL yn yr ymchwil arennau yn yr adolygiad hwn wedi'u defnyddio ar gyfer anaf acíwt i'r arennau (AKI) gan fod yr asesiad o AKI yn aml yn cael ei wneud o fewn 24 i 72 h ar ôl anaf pan fydd endonucleasau yn fwyaf gweithgar. . Mae'r rhestr o astudiaethau AKI yn hir ac yn cynnwys anafiadau gwenwynig, septig, trawsblannu ac anafiadau hypocsig. Yn y gwaith hwn, fe wnaethom arolygu’r modelau, mathau o ddatguddiad, triniaethau, llinellau amser asesu, a’r mathau o gelloedd yr effeithir arnynt yn yr astudiaethau hyn. Roedd yr astudiaethau a arolygwyd yn ymdrin â dulliau acíwt-cronig acíwt a chymysg o anafiadau i'r arennau a chlefyd cronig yn yr arennau.

Mae p'un a yw anaf i'r arennau gyda signal TUNEL-positif yn cael ei arsylwi mewn tiwbiau neu'r glomerwlws yn dibynnu ar y math o asiant neu afiechyd niweidiol. Er enghraifft, disgrifiwyd neffritis lupws mewn pobl a difrod nanoronynnau nicel fel bod â signalau TUNEL-positif glomerwlaidd llym [62,63]. Ar y llaw arall, roedd isgemia-atlifiad a neffropathi diabetig a achosir gan streptozotocin mewn llygod mawr yn cynhyrchu celloedd TUNEL-positif yn y tiwbiau yn unig [64,65]. Mae tiwbiau agos, dolen Henle, tiwbiau distal, a dwythellau cyfunol yn aml yn TUNEL-positif mewn modelau isgemia-atlifiad. Disgrifiwyd celloedd TUNEL-positif yn y glomeruli a'r tiwbiau mewn llygod mawr a oedd yn agored i gyffuriau fel cyclosporine A [66] a doxorubicin [67] neu ddeunyddiau cynnyrch defnyddwyr fel nanoronynnau sinc ocsid [68] ac mewn model llygod mawr o ddiabetes mellitus [67] 69]. Roedd AKI septig a achosir gan sioc mewn bodau dynol hefyd yn gysylltiedig â chelloedd glomerwlaidd a thiwbaidd TUNEL-positif [70]. rhwystriad coluddyn bach dolen gaeedig dagedig achosi TUNEL-positifrwydd yn yr aren in3h [87].

Gall AKI ddigwydd ar ôl trawsblannu ac anafiadau hypocsig. Mae gwrthod allograft mewn bodau dynol yn aml yn gysylltiedig â drychiad celloedd TUNEL-positif [88,89]. Ar ôl isgemia oer, gwelwyd celloedd TUNEL-positif fel arfer o fewn 2-24 h yn ystod atglifiad [90], neu'n fwy cul, rhwng 14 a 17 h ar ôl isgemia [91], ac weithiau rydym yn dal i gael ein harsylwi mor hwyr â 7 diwrnod yn gwrthod trawsblaniad [92]. Yn yr un modd, mewn modelau isgemia-atlifiad, arsylwyd celloedd TUNEL-positif amlaf 24 h ar ôl atlifiad [44,93,94], neu o fewn yr ystod rhwng 4 [95,96] a 72 h [97]. Mewn astudiaethau trawsblannu ac isgemig AKI, lleolwyd celloedd TUNEL-positif i gelloedd epithelial tiwbaidd distal a procsimol [44,93]. Yn llygodenarennauar ôl anaf isgemia-reperfusion, disgrifiwyd celloedd TUNEL-positif fel rhai wedi'u crynhoi yn y gyffordd corticomedullary, y targed arferol o anaf isgemig [98].

Gwelwyd anafiadau acíwt a chronig cymysg, lle'r oedd datguddiadau gwenwynig, cyflyrau afiechyd, a/neu asesiadau yn acíwt (hy, oriau, dyddiau) a chronig (hy, wythnosau, misoedd, blynyddoedd) yn yr un astudiaeth, mewn trawsblaniad dynol. gwrthod (biopsi 1 wythnos i 3 blynedd ôl-drawsblaniad) [88], haint firws hepatitis E moch (7 a 14 diwrnod ar ôl y brechiad) [52], straen a achosir gan niwmoperitonewm CO2 mewn hydronephroticarennau(hydronephrosis 2 wythnos, 2 ddiwrnod ôl-niwmoperitonewm) [53], glomerulonephritis ymledol mesangial a achosir gan wenwyn neidr (1 i 14 diwrnod ar ôl y pigiad) [99], rhwystr wreteral unochrog (1 i 14 diwrnod o rwystr) [100], amlygiad asetad wranyl (1 i 28 diwrnod o amlygiad) [101], neffropathi asid aristocholig (amlygiad dyddiol 5 a 30-dydd) [102], a hyperocsia newyddenedigol (profi 1 i 60 diwrnod ôl-enedigol, yn agored i hyperocsia yn gyntaf 14). dyddiau) [103]. Mae pedwar diwrnod ar ddeg ar ôl effaith yn bwynt amser asesu cyffredin iawn ar gyfer y mathau hyn o achosionanafiadau i'r arennau[52,53,99,101,103]. Yn y mwyafrif o achosion, lleolwyd celloedd TUNEL-positif mewn tiwbiau a dwythellau cyfunol. Yr unig eithriad oedd gwenwyndra gwenwyn neidr, a niweidiodd y glomeruli yn bennaf [99].

Cronigarenclefyd (CKD), a ddiffinnir fel presenoldebarendifrod neu ostyngiad yn y gyfradd hidlo glomerwlaidd (GFR) mewn pobl am fwy na 3 mis, hefyd yn bwnc cyffredin ar gyfer asesiad TUNEL, a all benderfynu a yw CKD yn gysylltiedig â blaengarniwed i'r arennau.Y CKD a astudir amlaf lle mae TUNEL yn cael ei gymhwyso yw neffropathi diabetig. Digwyddodd yr anaf a nodwyd gan TUNEL-positifrwydd mewn tiwbiau a podocytes [69] mewn cleifion diabetig â diabetes cyn dechrau profion TUNEL yn amrywio o 7 i 30 mlynedd [104,105] a 2 i 16 wythnos ar ôl triniaeth streptozotocin mewn cnofilod [106,107]. Adroddwyd am histopatholeg TUNEL-positif tebyg yn neffropathi imiwnoglobwlin A [22]. Mewn neffritis lupws a glomerulonephritis membranoproliferative, gwelwyd TUNEL-positifrwydd yn bennaf yn y glomeruli [62,108,109]. Ar y llaw arall, arsylwodd astudiaethau diogelwch cyffuriau o cisplatin [110], cloroquine [45], doxorubicin [67], finasteride [23], tacrolimus [111], a levetiracetam [24] ddifrod tiwbaidd yn bennaf. Yn yr un modd, disgrifiwyd yr anaf acíwt parhaus a nodwyd gan gelloedd tiwbaidd TUNEL-positif mewn astudiaethau o neffropathi asid wrig [112], diffyg methionin [48], amlygiad i tocsinau amgylcheddol microcystin-LR [50], a chadmiwm [113], ac yn cysylltiad â chalsiwm-oxalate a achosirarencerrig [114] a nanoronynnau calchynnu [115]. Er bod nodi'r difrod cynyddol i'r arennau yn ystod CKD trwy ddefnyddio assay TUNEL yn offeryn diagnostig defnyddiol, efallai y byddai cyfuno'r assay TUNEL ag imiwn-histochemistry (IHC) hyd yn oed yn fwy addysgiadol wrth benderfynu ar fecanwaith yr anaf.

Technegau Meintoli a Chydleoli TUNEL

Mae dulliau meintioli TUNEL yn amrywio. Yn y mwyafrif o adroddiadau, mae celloedd / niwclysau TUNEL-positif yn cael eu meintioli fel y cant o gyfanswm y celloedd / niwclysau [83,116,117]. Mae'n ymddangos mai dyma'r peth iawn i'w wneud, er nad yw nifer y celloedd TUNEL-positif yn debygol o gyfateb yn union i nifer y celloedd marw. Efallai na fydd rhai celloedd wedi cyrraedd lefelau adnabyddadwy o ddarnio DNA, tra gallai eraill fod wedi cael eu dileu eisoes gan facroffagau. Defnyddir meintioli nifer y celloedd TUNEL-positif fesul uned sgwâr (mm2) hefyd [118], ond mae'r dull hwn yn ymddangos yn llai manwl gywir oherwydd ei fod yn dibynnu ar leoliad a chynnwys math celloedd yr ardaloedd. Mae adrannau cortigol yn bennaf yn cynnwys glomerwli, tiwbiau, pibellau gwaed, a phelydrau medwlari, tra bod adrannau medullary yn bennaf yn cynnwys dolenni o Henle, dwythellau casglu, a phibellau gwaed. Mae meintioli "fesul Fifield" yn sicr yn dibynnu ar beth yw'r maes [72,119], ac mae meintioli "fesul adran", hyd yn oed yn fwy, heb ei ddiffinio [61,120]. Ymddengys bod mesuriadau a nodwyd yn wael, megis "sgôr histolegol" [121], "mynegai apoptotic" [113], "cyfradd apoptosis" [92], "canran apoptosis" [122], neu ganran o reolaeth heb ei drin [123,124]. fod hyd yn oed yn llai priodol, a gwneud dehongli yn anodd ac na ellir ei gymharu â mwyafrif yr astudiaethau.

Mae marwolaeth celloedd mewn celloedd cyfagos yn dechrau'n anwastad oherwydd ei fod yn dibynnu ar fasgwleiddio, cylchred celloedd, a newidynnau eraill. Mae hyn yn aml yn arwain at staenio TUNEL anwastad o gelloedd yn y meinwe [45,96,125]. Yn syndod, ni ddefnyddir dwyster cyffredinol y signal TUNEL-positif ar gyfer mesur TUNEL, er ei fod yn dibynnu'n uniongyrchol ar raddfa darnio DNA. Mae hyn efallai oherwydd bod celloedd yn cael eu hystyried yn farw yn annibynnol ar ddwysedd y signal TUNEL, gan na all cell fod yn "fwy marw" os yw'r staenio TUNEL yn ddwysach. Er ei bod yn anodd cymharu astudiaethau sy'n defnyddio amrywiaeth eang o ddulliau i feintioli canlyniadau TUNEL, mae maint y celloedd TUNEL-positif mewn anifeiliaid rheoli fel arfer yn is na 2 y cant [75,99,100,116,126]. Mae anaf acíwt yn gysylltiedig â chynnydd ~5-40 × mewn positifrwydd TUNEL [79,126,127]. Yn ystod anaf cronig, mae'r cynnydd mewn celloedd TUNEL-positif ychydig yn is, ~2-{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{19}{19}})plyg)}plyg, [29,43,65)) o'i gymharu â rheolaethau heb eu trin.

Dyluniwyd yr assay TUNEL cychwynnol yn seiliedig ar staenio diaminobenzidine (DAB) ar gyfer microsgopeg ysgafn [14,15]. Defnyddiwyd y dull traddodiadol hwn o hyd mewn dwy ran o dair o'r astudiaethau a arolygwyd yn yr adolygiad hwn ac yn y mwyafrif llethol o astudiaethau biopsi dynol. Gwneir y meintioliad trwy gyfrif celloedd â llaw ac, er ei fod yn fanwl gywir, mae'n cymryd llawer o amser. Yn aml, ni ddefnyddir meintioli o gwbl, a chyflwynir y canlyniadau gan ddefnyddio delweddau o samplau wedi'u trin a'u staenio fel tystiolaeth syml bod marwolaeth celloedd wedi digwydd. Gall awtomeiddio gyflymu'r broses feintioli [128,129]. Fodd bynnag, ni ellir cyfuno DAB ag unrhyw staen arall yn yr un sampl, ac felly dim ond nifer y celloedd marw y gall TUNEL sy'n seiliedig ar DAB ei ddarparu, heb unrhyw adnabyddiaeth o'r math o gell (ac eithrio cydnabyddiaeth weledol) neu fecanwaith marwolaeth celloedd.

Er bod astudiaethau dynol yn dibynnu'n helaeth ar TUNEL seiliedig ar DAB gan ddefnyddio microsgopeg ysgafn, mae tua hanner yr astudiaethau anifeiliaid yn defnyddio microsgopeg fflwroleuol FL (Ffigur 3). Mae TUNEL fflwroleuol yn ddeniadol yn weledol, yn hawdd ei ddehongli, ac mae ganddo nifer o fanteision mawr. Yn ogystal â meintioli manwl gywir trwy adnabod niwclysau TUNEL-positif neu ddwysedd cymedrig y lliw, gellir colocalized signal TUNEL fflwroleuol FL â lliwiau eraill ar gyfer histocemeg (ee, DAPI) (Ffigur 3A) neu IHC (Ffigur 3B). Yn yr olaf, efallai y bydd defnyddio marcwyr protein yn helpu i nodi signalau TUNEL-positif sy'n gysylltiedig â gwahanolarenadrannau neu roi gwybodaeth am y math o farwolaeth celloedd. Ni allem ddod o hyd i unrhyw enghreifftiau o TUNEL wedi'i gyfuno â staenio gwrthgyrff dwbl IHC. Er y byddai cyfuniad o'r fath yn addysgiadol iawn, er enghraifft, ar gyfer nodi mecanwaith marwolaeth celloedd mewn rhai mathau o gelloedd, gallai'r anawsterau technegol sy'n gysylltiedig â staenio o'r fath fod yn drech na'r manteision.

AdnabodarenYn sicr nid yw math o gell yn broblem i berson profiadolarenpatholegydd [104]. Oherwydd hyn, mae'r defnydd o farcwyr ychwanegol ar gyfer adnabod math o gelloedd, er enghraifft, defnyddio CD31 ar gyfer adnabod celloedd endothelaidd [130], yn brin. Fodd bynnag, yn aml defnyddir marcwyr protein IHC ar gyfer nodweddu anaf i feinwe. Mae'r rhan fwyaf o astudiaethau'n defnyddio TUNEL-positifrwydd fel yr unig dystiolaeth o apoptosis. Mewn astudiaethau eraill, mae cydnabod nad yw positifrwydd TUNEL yn benodol ar gyfer apoptosis wedi arwain at gyfuno llawer o farcwyr morffolegol (ee, hematoxylin ac eosin neu asid cyfnodol-Schiff), biocemegol, a marcwyr IHC â staenio TUNEL i gadarnhau apoptosis. Y marciwr a ddefnyddir amlaf ar gyfer apoptosis sy'n ddibynnol ar caspase yw hollt (gweithredol) caspase-3 trwy ddefnyddio gwrthgorff nad yw'n adnabod y caspase maint llawn-3 [131,132]. Roedd profion TUNEL a caspase holltog yn dangos staen tiwbaidd yn unig, nid glomerwlaidd, mewn isgemia-atlifiad llygod mawr [64]. Roedd astudiaethau caspase eraill yn defnyddio caspase-1 [27], -9 [53], -11 [28], a -12 [75]. Roedd marcwyr apoptotig eraill yn cynnwys teulu lymffoma celloedd B 2 (Bcl2) o broteinau Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49], a Bad [43]; derbynnydd apoptotig Fas [52] a derbynnydd apoptotic-ligand FasL [66]; bocs pen fforch (FOX) ffactorau trawsgrifio protein Fox01 [133] a Fox03 [27]; a cytochrome c [53]. Nodwyd llid gan IHC o ffactor-alffa necrosis tiwmor (TNF) [134]; ffactorau twf tiwmor TGF [66] a TGF- 1 [135]; serine/threonine kinase 1 (SGK1) [135]; flavoprotein trosglwyddo electron, beta-is-uned (ETF) [136]; Janus kinase-2 (JAK2) [137]; transducer signal a activator trawsgrifio 3 (STAT3) [137]; ffactor niwclear kappa-golau-gadwyn enhancer o gelloedd B actifedig (NF-κB) [137] a'i atalydd protein IκB [137]. Canysarenasesiad anaf, moleciwl anaf i'r arennau-1 (KIM-1) [24], sianel aquaporin-1 (AQP-1) [45], ffactor hypocsia-anwythol {{7} }ffactor trawsgrifio alffa (HIF-1) ​​[103], cludwr asid amino math Asc-1 (Asc-1) [121], targed mamalaidd o rapamycin (mTOR) [131] kinase , a defnyddiwyd transglutaminase II [89]. Astudiwyd anaf ocsideiddiol i'r arennau gan ddefnyddio marcwyr fel 8-hydroxyguanosine (8OHdG) [102], lipocalin cysylltiedig â neutrophil gelatinase (NGAL) [102], deacetylase sirtuin sy'n ddibynnol ar NAD-1 (SIRT1) [138] , a heme oxygenase 1 (HO-1) [90]. Astudiwyd Kinases yn ddwys, gan gynnwys llwybr c-Jun N-terminal kinase (JNK) [101], phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/ffactor niwclear erythroid 2-ffactor trawsgrifio ffactor 2 cysylltiedig (PI3K/). Llwybr Akt/Nrf2) [46], pannexin-1 (PANX1) protein cyffordd bwlch pilen plasma [26], a kinase protein wedi'i actifadu gan mitogen / kinase a reoleiddir gan signal allgellog (MAPK / ERK) [26]. Roedd astudiaethau o endonucleases apoptotig yn cynnwys DNase (CAD) a ysgogwyd gan caspase [139], DNase I [108], ac EndoG [139], ac roedd marcwyr difrod DNA yn cynnwys protein tiwmor p53 (p53) [99] a phrotein cysylltiedig â dynamin 1 (PARP1). ) [66]. Canfu rhai astudiaethau hefyd fod yr asesiad o apoptosis endoplasmig reticwlwm straen-gyfryngol ac anaf meinwe yn ddefnyddiol [75].

O ystyried nifer fawr o astudiaethau mecanistig a arolygwyd a'r fantais o gyfuno TUNEL â marcwyr IHC ar gyfer nodi mecanweithiau marwolaeth celloedd, byddai rhywun yn disgwyl llawer o astudiaethau gan ddefnyddio colocalization rhwng y ddau. Gall y dadansoddiad gael ei berfformio gan gydleoli picsel-wrth-picsel rhwng celloedd TUNEL-positif a marcwyr IHC, dwyster cymedrig marciwr IHC mewn ardaloedd TUNEL-positif, neu signal TUNEL-positif yn golygu dwyster mewn ardaloedd marciwr-positif IHC. Yn anffodus, dim ond mewn ychydig o astudiaethau y defnyddiwyd y fantais hon o TUNEL. Cafodd celloedd TUNEL-positif eu cydleoli gyda caspase wedi hollti-3 i mewnarentiwbiau yn ystod gwenwyndra acetaminophen mewn llygod mawr [74]. Caniataodd colocalization IHC gyda signal TUNEL-positif adnabod marwolaeth celloedd o gelloedd mesangial yn ystod neffritis Habu [99]. Mewn microsgopeg ysgafn, gwnaed cydleoli â marcwyr mecanistig o wenwyndra mewn adrannau cyfresol, fel yr adroddwyd gan Ott et al. [89].

Problemau a Chyfyngiadau TUNEL

Gall nifer o broblemau posibl godi a dylid eu disgwyl wrth weithio gyda TUNEL. Un yw bod termini DNA 30OH yn digwydd nid yn unig yn ystod marwolaeth celloedd o ganlyniad i weithred endonuclease ond hefyd fel metabolyn canolradd arferol ym mron pob adwaith ensymatig â DNA. Prif swyddogaeth cell sy'n cynhyrchu termini 30OH yw synthesis DNA, lle gall nifer o ddarnau Okazaki gynhyrchu signal TUNEL ffug-bositif yn ddamcaniaethol, yn enwedig mewn addasiadau hynod sensitif i'r assay. Yn ystodanaf i'r arennau,Gall atgyweirio DNA hefyd gyfrannu at signalau TUNEL-positif ffug o ganlyniad i weithred endonuclease AP. Gall anaf ocsideiddiol enfawr i'r arennau a achosir gan anaf cemegol (hydrogen perocsid, bleomycin) neu anaf corfforol (arbelydru gama) ychwanegu at nifer y pennau 30OH, gan gynyddu'r darlleniadau TUNEL ffug-bositif ar wahân i ddarniad DNA cyfryngol endonuclease.

Yn amlach ac yn fwy tebygol, gall amodau arbrofol wedi'u gosod yn amhriodol o'r adwaith TdT (amser, tymheredd, gweithgaredd ensymatig, neu gydffactorau) arwain at gefndir signal TUNEL-positif uchel yn artiffisial. Er nad yw wedi'i ddiffinio o hyd o ran yr hyn a ystyrir yn waelodlin arferol ar gyfer samplau meinwe arennau heb eu trin, mae'n ymddangos yn gredadwy y byddai tua 1 y cant o gyfanswm y celloedd yn nifer rhesymol. Yn sicr, mae cefndir 10 y cant neu uwch yn dystiolaeth glir o naill ai amodau asesu annodweddiadol a heb eu mireinio neu wyriad oddi wrth amodau storio sampl priodol.

Problem arall i'w ddisgwyl yw gweithgaredd DNase I isel mewn rhai mathau o gelloedd (ee, endotheliwm),arenadrannau (ee, glomeruli), neu feinweoedd patholegol (ee, tiwmorau). Dylid disgwyl i'r celloedd hyn ddangos positifrwydd TUNEL isel, nid oherwydd eu bod yn gallu gwrthsefyll anafiadau, ond oherwydd nad oes digon o weithgaredd endonuclease i gynhyrchu signal mesuradwy yn TUNEL. Yn ein profiad ni, gall hyd yn oed newidiadau rhwng {{{0}}.01 y cant a 0.1 y cant o gelloedd positif TUNEL fod yn ystadegol arwyddocaol a'u defnyddio fel tystiolaeth gadarn o anaf i'r arennau (o feinwe arall).

Yn olaf, mae problem gyda meintioli staen TUNEL yn codi pan fo maint y darnio DNA yn rhy uchel, er enghraifft, ar gamau hwyr marwolaeth celloedd neu mewn anafiadau dwysedd uchel, lle na ellir gwrth-staenio'r DNA sy'n weddill yn iawn â DAPI oherwydd dadosod y helics dwbl (Ffigur 3D). Yn yr achosion hyn, mae signalau TUNEL-positif yn "hongian yn yr awyr", ac mae'n ymddangos nad ydynt yn gysylltiedig â niwclews. Mae'n dod yn gyfrifoldeb patholegydd i ddehongli'r rhain fel celloedd TUNEL-positif yn hytrach nag arteffact. Gyda TUNEL wedi'i labelu â fflworoleuedd, mae perygl o nodi autofluorescence cefndir mewn meinwe fel TUNEL-positivity [140]. Yn yr achosion hyn, argymhellir newid i TUNEL sbectrwm coch [51,54].

Patrymau TUNEL fel Ffynhonnell Gwybodaeth Ychwanegol

Gellir gwahaniaethu'n glir sawl patrwm TUNEL a'u defnyddio i bennu mecanwaith posibl a graddau anaf (Tabl 1, Ffigur 3). Fel arfer, mae math niwclei-yn-unig o batrwm TUNEL yn cael ei gynhyrchu gan anaf ysgafn, tra bod anaf cryfach (hy, amlygiad uchel) yn arwain at staenio cryfach a dadelfennu cnewyllyn neu gelloedd. Patrwm TUNEL cwbl apoptotig yw darnio niwclear o ganlyniad i ffurfio cyrff apoptotig (Ffigur 3E). Gwelwyd darnau bach o gnewyllyn TUNEL-positif, sy'n debygol o fod yn gyrff apoptotig, mewn isgemia-atlifiad llygod mawr yn 24-72 h [97]. Gwelwyd cyrff apoptotig hefyd gyda labelu TUNEL o niwclysau yn yr epitheliwm tiwbaidd arennol ac interstitium 14 diwrnod ar ôl anaf isgemia-atlifiad mewn llygod mawr [141]. Fe wnaeth dosau cynyddol o olew lafant leihau patrymau TUNEL niwclysau yn unig a'u trosi i TUNEL tebyg i necrosis gyda gollyngiadau cytoplasmig [94]. Roedd yr olaf o ganlyniad i ddinistrio amlen niwclear oherwydd gweithrediad proteinasau a lipasau mewn necrosis. Gwelwyd TUNEL Cytoplasmig (Ffigur 3F) a welir fel cytoplasm TUNEL-positif mewn microsgopeg ysgafn yn y model rhabdomyolysis mewn tiwbiau llygod mawr [142] ac mewn podocytau wedi'u meithrin ym mhresenoldeb glwcos uchel ac mewn neffropathi diabetig mewn llygod [135]. Disgrifiwyd TUNEL cytoplasmig hefyd mewn isgemia arennol-atlifiad mewn llygod gan ddefnyddio TUNEL fflwroleuol FL [98] ac mewn isgemia-atlifiad mewn llygod mawr gan ddefnyddio microsgopeg ysgafn [143]. Difrod dwys a diwbaidd yn unig a achosir gan mercuric clorid gyda staenio TUNEL cytoplasmig cryf yn arwydd o ddifrod pilen niwclear [60]. Os bydd yr anaf yn parhau neu os bydd dos yr asiant niweidiol yn cynyddu, gellir trosi TUNEL cytoplasmig i ddarlun "llanast" o TUNEL gwasgaredig (Ffigur 3G) a briodolir i gamau hwyr o ddinistrio celloedd oherwydd necrosis a gollyngiadau cytoplasm cellog a malurion. Er enghraifft, gwelwyd TUNEL cytoplasmig a gwasgaredig mewn llygod wedi'u trin â cisplatin [71,72] a llygod mawr [144], ac mewn anaf podocyte mewn llygod mawr diabetig a achosir gan streptozotocin [145]. Gwelwyd TUNEL necrotig gwasgaredig hefyd yn ystod nephrotoxicity a achosir gan wranyl asetad mewn llygod [101]. Yn olaf, newidyn signal TUNEL arall i roi sylw iddo yw dwyster signalau TUNEL-positif, a all wyro o gell i gell yn dibynnu ar nifer yr egwyliau (graddfa anaf) y mae pob cell yn eu profi, fel y dogfennwyd gan rai astudiaethau [45,96,125 ]. Ar gyfer modelau lle arsylwir ar ddwysedd signal TUNEL amrywiol, argymhellir mesur yn ôl nifer y gwrthrychau TUNEL-positif a dwyster cymedrig y staenio.

Casgliadau

Oherwydd y gweithgaredd uchel o endonucleases apoptotig yn yr aren, yn enwedig DNase I ac EndoG, y defnydd o TUNEL ar gyferymchwil a diagnosis arennauyn addysgiadol iawn. Efallai y bydd hyd yn oed yn fwy defnyddiol os caiff TUNEL ei gymhwyso y tu hwnt i'w ddefnydd cychwynnol fel dull i nodi apoptosis. Mae cymhwyso TUNEL ar gyfer astudiaethau apoptosis yn unig yn enghraifft dda o sut y gellir camgyfeirio gwyddoniaeth yn anfwriadol trwy ddull a ddefnyddir yn amhriodol. Er gwaethaf ei ddefnydd fel assay anaf acíwt yn bennaf, gellir cymhwyso TUNEL yn llwyddiannus i asesu AKI a CKD. Fodd bynnag, yn CKD, dylid disgwyl i raddau TUNEL-positif fod yn is nag mewn anaf acíwt. Oherwydd bod gweithgaredd endonucleases (yn bennaf, DNase I) yn llawer uwch mewn epitheliwm tiwbaidd nag mewn adrannau arennau eraill, mae anaf i tiwbyn yr arennau fel arfer yn cael ei ystyried yn fwy amlwg. Fodd bynnag, gellir astudio anafiadau glomerwlaidd neu fasgwlaidd hefyd gan ddefnyddio TUNEL os yw'r anaf yn digwydd yn yr adrannau hyn mewn gwirionedd. Mae cydleoli TUNEL fflwroleuol FL gyda marcwyr IHC yn caniatáu adnabod a chysylltu mathau o gelloedd a mecanweithiau marwolaeth celloedd â signalau TUNEL. Gall meintioli TUNEL gyfrannu gwybodaeth werthfawr am raddau marwolaeth celloedd, a gall cymhwyso meddalwedd dadansoddi delweddau fod yn ddefnyddiol iawn yn hyn o beth. O ystyried yr amrywiaeth o batrymau TUNEL, mae delweddau cynrychioliadol yn cael eu hawgrymu'n gryf i'w sefydlu a'u harddangos

Arwyddion TUNEL sy'n cael eu hystyried yn bositif. Yn olaf, dylid defnyddio patrymau TUNEL fel ffynhonnell gwybodaeth ychwanegol, megis mecanwaith marwolaeth celloedd a graddau'r gwenwyndra. Er enghraifft, gall gwahaniaethu rhwng cyrff apoptotig TUNEL-positif, presenoldeb signalau TUNEL cytoplasmig, neu batrymau TUNEL gwasgaredig helpu i nodi celloedd TUNEL-positif apoptotig vs necrotig ar gyfer dehongliadau mwy manwl gywir o ganlyniadau ymchwil a diagnosteg.

triniaeth anhwylder arennau cyffroi rhywiol