​Yn Seiliedig ar Ffarmacoleg Rhwydwaith Ac Arbrofion Anifeiliaid I Archwilio Effaith Glycoside Phenylethanoid O Cistanche Tubulosa Ar Effaith Neffropathi Diabetig

Crynodeb: Amcan Archwilio effaithCistancheglycosidau ffenylethanol(CPhGs) ymlaenclefyd yr arennau diabetig(DKD) yn seiliedig ar ffarmacoleg rhwydwaith ac arbrofion anifeiliaid. Dulliau Defnyddiwyd dull UHPLC-QE-MS i ddadansoddi'rcydrannau cemegol CPhGs. Defnyddiwyd cronfeydd data TCMSP a'r Swistir i sgrinio'r cydrannau craidd. Defnyddiwyd cronfeydd data OMIM a GeneCards i gael targedau cysylltiedig â DKD. Ar ôl cyrraedd targedau cyffredin, defnyddiwyd gwefan STRING i adeiladu rhwydwaith rhyngweithio protein. Defnyddiwyd cronfa ddata DAVID ar gyfer dadansoddiad llwybrau GO, KEGG a defnyddiwyd meddalwedd Cytoscape i adeiladu rhwydwaith “CPhGs craidd cydran-targed-llwybr”. Dewiswyd deg o lygod mawr ar hap fel y grŵp arferol, a chafodd y llygod mawr sy'n weddill eu bwydo â phorthiant siwgr uchel a braster uchel a rhoddwyd un pigiad mewnperitoneol o STZ i sefydlu model DKD. Fe'u rhannwyd yn grŵp model, grŵp dapagliflozin (1 mg/kg), a CPhGs dos uchel a Chanolig ac isel (500, 25{{40}}, 125 mg/kg) o grwpiau, 10 anifail ym mhob grŵp, ymyriad cyffuriau am 6 wythnos, arsylwyd cyflyrau cyffredinol, penderfynwyd pwysau'r corff a phrofwyd glwcos yn y gwaed bob wythnos; Casglwyd wrin 24 awr ar ôl y dos olaf. Canfod 24-cyfanswm awr o brotein wrin (24-UTP); casglu gwaed o'r aorta abdomenol a'i aberthu, serwm ar wahân, a chanfod nitrogen urea (BUN), asid wrig (UA), cyfanswm colesterol (TC), triglyserid (TG), a phwysedd gwaed uchel. Defnyddiwyd lefelau lipoprotein dwysedd uchel (HDL) a lipoprotein dwysedd isel (LDL), staen AU a staenio Masson i arsylwi newidiadau patholegol mewn meinwe arennol, defnyddiwyd ELISA i ganfod serwm IL-1, IL{{17} }, a lefelau TNF-, a defnyddiwyd blot Gorllewinol i ganfod meinwe arennol. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, mynegiant protein SOCS3. Canlyniadau Canfuwyd cyfanswm o 699 o gydrannau gan dechnoleg UHPLC-QE-MS. Ar ôl sgrinio, cafwyd 16 o gydrannau craidd GRhGau a 323 o dargedau cysylltiedig. Rhannodd CPhGs a DKD 99 o dargedau. Y targedau allweddol oedd STAT3, SRC, EGFR, ac ati. Sgriniodd dadansoddiad llwybr KEGG 151 o lwybrau signalau, gan ddangos y gallai'r llwybr signalau IL-17, llwybr signalau PI3K/Akt, llwybr signalau TNF, ac ati chwarae rhan allweddol mewn triniaeth DKD gan CPhGs. Gall CPhGs gynyddu pwysau corff llygod mawr DKD (P ＜0.01), lleihau'r defnydd o ddŵr (P ＜0.01), rheoleiddio metaboledd glwcos a lipid, lleihau 24- lefelau UTP a BUN (P＜0.01), a gwella meinwe'r arennau . Fe wnaeth difrod patholegol leihau mynegiant protein p-JAK2/JAK2 a p-STAT3/STAT3 mewn meinwe arennol (P ＜0.01) a chynyddu mynegiant protein SOCS3 (P ＜0.01). Casgliad Mae CPhGs yn ymyrryd yn DKD trwy gydrannau lluosog, targedau lluosog, a llwybrau lluosog, o bosibl trwy atal JAK2 /

llwybr signalau STAT3.

Geiriau allweddol: Cistanche ffenylethanol glycoside; neffropathi diabetig; UHPLC-QE-MS; ffarmacoleg rhwydwaith; arbrawf anifeiliaid; Llwybr signalau JAK2 /STAT3

PA MOR HYD Y MAE'N EI EI EI GYNNIG I CISTANCHE WEITHIO I GLEIFION YR AREN?

Clefyd yr arennau diabetig (DKD), fel un o gymhlethdodau microfasgwlaidd pwysicaf diabetes, nid yn unig yw'r prif ffactor sy'n arwain atclefyd cronig yn yr arennauond hefyd prif achos clefyd arennol diwedd cyfnod (ESRD) ledled y byd. Rheswm [1-2]. Mae triniaeth glinigol DKD yn bennaf yn cynnwys rheoli siwgr gwaed, pwysedd gwaed a lipidau gwaed yn gyntaf, ac yn ail amddiffyn swyddogaeth arennol, osgoi'r defnydd o gyffuriau neffrotocsig, a gwella ffordd o fyw [3-4]. Fodd bynnag, oherwydd pathogenesis cymhleth DKD a diffyg targedau ymyrraeth penodol, mae gan opsiynau triniaeth presennol gyfyngiadau ac nid ydynt yn effeithiol. Mae nifer yr achosion o DKD cam olaf yn dal i godi. Felly, mae'n arwyddocaol iawn dod o hyd i gyffuriau naturiol effeithiol.

Cistanche Deserticola Y. C. Ma neuCistanche C.Mae coesau sychion cigog oCistanche tubulosa (Schenk) Wightgyda dail cennog [5] wedi'u cofnodi gyntaf yn y "Shen Nong's Materia Medica" ac fe'u rhestrwyd fel rhai o'r radd flaenaf. Maent yn cael eu hadnabod fel "ginseng anialwch" [6] . Maent yn felys, yn hallt, ac yn gynnes. , yn dychwelyd i'r arennau a meridians coluddyn mawr, ac mae ganddo effeithiau maethlon yang arennau, ailgyflenwi hanfod a gwaed, lleithio'r coluddion, a charthydd. Mae ymchwil yn dangos bod glycosidau ffenylethanoid (CPhGs) yn un o'i brif gynhwysion gweithredol ac yn gyfrifol am ei ddatblygiad.

Y sail berthnasol ar gyfer cyflawni effeithiau ffarmacolegol; Mae gan echdyniad Cistanche effeithiau gwrth-diabetig [7-8], canser gwrth-iau [9], amddiffyniad arennol [10-11], niwro-amddiffynnol [12-13] ac effeithiau ffarmacolegol eraill, ond ar hyn o bryd, CPhGs ddim yn effeithiol wrth drin DKD. Mae ei effeithiau a'i fecanweithiau yn aneglur.

Defnyddiodd yr astudiaeth hon ffarmacoleg rhwydwaith a dulliau tocio moleciwlaidd [14], gan gymryd CPhGs fel y gwrthrych ymchwil, rhagfynegi a dadansoddi ei brif gynhwysion gweithredol a thargedau posibl ar gyfer trin DKD, ac yna sefydlu cyfuniad o streptozocin (STZ) - uchel a achosir gan y Defnyddiwyd model llygod mawr DKD sy'n cael ei fwydo â phorthiant lipid fel testun ymchwil in vivo, i ddarparu cyfeiriad ar gyfer ehangu clinigol a chymhwyso triniaethau cysylltiedig ac ymchwil bellach ar y mecanwaith gweithredu.

1 deunydd

1.1 Anifeiliaid

70-Cafodd llygod mawr SD gwrywaidd wythnos oed gyda lefel SPF, pwysau corff (240±20) g, eu prynu o Ganolfan Arbrofi Anifeiliaid Prifysgol Feddygol Xinjiang [Trwydded Defnydd Anifeiliaid Arbrofol Rhif SYXK (newydd) {{4} }], yn Cafodd yr anifeiliaid eu magu'n addasol am 1 wythnos ar dymheredd o (22 ±2) gradd, lleithder cymharol o 50% i 70%, a chylchred golau a thywyll bob yn ail 12 h/12 ​​h. Cymeradwywyd yr arbrawf gan Bwyllgor Moeseg Anifeiliaid Canolfan Feddygol Anifeiliaid Arbrofol Prifysgol Feddygol Xinjiang (rhif moeseg IACUC-20220127-19).

1.2 Adweithyddion a chyffuriau

CPhGs (batch number 201610, purity >Darparwyd 80%) gan Xinjiang Hotan Dichen Co, Ltd. Prynwyd Dapagliflozin (rhif swp NB2248) o AstraZeneca, DU. Prynwyd porthiant siwgr uchel a braster uchel (Cat. No. Boaigang-B1135DM) a STZ (Swp Rhif 2021110307) gan Beijing Boai Port Biotechnology Co, Ltd; microalbwmin wrin (Swp Rhif 20220611), wrea nitrogen (Swp Rhif 20220626), asid wrig (Swp Rhif 20220613), Cyfanswm colesterol (rhif swp 20220615), triglyseridau (rhif swp 20220616), high-protein-rhif 20616 (rhif swp 20220616), high-protein ), a phrynwyd lipoprotein dwysedd isel (rhif swp 20220615) gan Sefydliad Biobeirianneg Nanjing Jiancheng; rhyngleukin-6 (IL-6, rhif lot JL20896), rhyngleukin-1 (IL-1 , rhif lot JL20884), a ffactor necrosis tiwmor- (TNF- , rhif lot 13202 ) eu prynu oddi wrth Shanghai Jianglai Biotechnology Co, Ltd; gwrthgorff polyclonaidd cwningen JAK2 (rhif lot 22v9316), gwrthgorff polyclonal cwningen p-JAK2 (rhif lot 78g9360), gwrthgorff polyclonaidd cwningen STAT3 (rhif lot 15x8824), gwrthgorff polyclonaidd cwningen p-STAT3 (rhif lot 74m1478), SOCS3 gwrthgorff polyclonaidd cwningen rhif 31d4841) eu prynu i gyd gan Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co, Ltd; Prynwyd gwrthgorff polyclonaidd IgG gwrth-gwningen gafr â label HRP (rhif swp 20000758) gan Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -actin gwrthgorff monoclonaidd cwningen (rhif swp AC230205001), byffer lysis RIPA (rhif swp 20220416), pecynnau penderfynu crynodiad Protein BCA (rhif swp 20230401) gan Beijing Solebao Technology Co, Ltd.

1. 3 Offerynau

Vanquish cromatograffaeth hylif perfformiad uwch-uchel, sbectromedr màs cydraniad uchel Q Exactive Focus, centrifuge Heraeus Fresco17, darllenydd microplate awtomatig FC (Thermo Fisher Scientific, UDA); JXFSTPRP-24 grinder (Shanghai Jingxin Technology Co, Ltd.); Mesurydd dŵr pur Mingche D24 UV (Cwmni Merck Millipore yr Almaen); ACQUITY UPLC BEH C18 colofn (1. 7 μm, 2. 1 mm × 100 mm) (American Waters Company); mesurydd glwcos gwaed Accu Chek Performa (Cwmni Roche Swistir); cryostat CM1850UV, microsgop fflworoleuedd unionsyth DM300 (Cwmni Leica, yr Almaen); GL-88Mesurydd fortecs B (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); cydbwysedd dadansoddol electronig (Cwmni Bio-Rad, UDA).

2 ddull

2. 1 dadansoddiad UHPLC-QE-MS

2.1.1 Paratoi datrysiad prawf

Pwyswch 100 mg CPhGs, ychwanegu 500 μL 80% methanol, fortecs am 30 s, ultrasonicate mewn baddon dŵr iâ am 1 awr, gadewch i sefyll ar -40 gradd am 1 h, centrifuge ar 4 gradd , 12 000 r/munud am 15 munud, allsugnwch y supernatant, 0. Hidlo trwy bilen microfandyllog 22μm a'i storio mewn oergell -80 gradd.

2.1.2 Cyflyrau cromatograffig

ACQUITY UPLC BEH C18 colofn (1. 7 μm, 2. 1 mm × 100 mm); acetonitrile cyfnod symudol (A) -1% asid fformig (B), elution graddiant (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 i 12 min, 75% i 98% A; 12 i 14 min, 98% A; 14 i 14. 1 min, 98% i 15% A; Cyfradd llif cyfaint 0 . 5 mL/munud; tymheredd colofn 35 gradd; cyfaint pigiad 5 μL.

2.1.3 Amodau sbectrometreg màs

modd sgan llawn ddMS2 llawn-sgan; cyfradd llif cyfaint nwy gwain 45 arb; cyfradd llif cyfaint nwy ategol 15 arb; tymheredd capilari 400 gradd; egni gwrthdrawiad yn y modd NCE 15% ~ 30% ~ 45% cylch; foltedd chwistrellu ± 4. 0 kV.

2.2 Ymchwil Ffarmacoleg Rhwydwaith

2. 2. 1 CPhGs

Sgrinio targed cydran: Didoli'r cydrannau cemegol a ddadansoddwyd gan UHPLC-QE-MS yn ôl cynnwys cymharol, a dileu'r rhai nad yw eu strwythurau cemegol wedi'u pennu eto. Mewnbynnu rhif cyfresol InChIKey y cynhwysion a sgriniwyd i gronfa ddata TCMSP i gael paramedrau ffarmacocinetig pob cynhwysyn. Yn seiliedig ar amodau bio-argaeledd geneuol (OB) > 30% a thebygrwydd cyffuriau (DL) > 0.18, bydd ymgeiswyr sy'n bodloni'r gofynion yn cael eu sgrinio. Rhowch rif SMILES pob cydran yng nghronfa ddata Rhagfynegiad Targed y Swistir i ragfynegi'r targed, a chael targed cydran gemegol y CPhGs.

2. 2. 2 DKD

Sgrinio targed afiechyd Defnyddiwch "neffropathi diabetig" fel y term chwilio i chwilio am dargedau afiechyd yng nghronfeydd data OMIM, GeneCards a NCBI.

2. 2. 3 Cydran-targed-adeiladu rhwydwaith clefyd

Sicrhawyd traws-dargedau cydrannau a chlefydau CPhGs trwy fapio meddalwedd R, a defnyddiwyd meddalwedd Cytoscape 3.7.2 i adeiladu system rhwydwaith targed cydran, lle bu i'r ategyn dadansoddi ganfod targedau craidd.

2. 2. 4 Adeiladu rhwydwaith rhyngweithio protein-protein (PPI)

Mewnforio'r proteinau targed croestoriad o gydrannau a chlefydau i gronfa ddata STRING, adeiladu rhwydwaith rhyngweithio protein-protein (PPI), dileu proteinau heb nodau cysylltiedig yn y rhwydwaith, a gosodwch lefel hyder y sgôr rhyngweithio protein isaf i {{1} }.700. Adeiladu rhwydwaith PPI, lawrlwytho ei ganlyniadau fformat TSV, eu mewnforio i feddalwedd Cytoscape 3.7.2, a defnyddio'r ategyn dadansoddi i sgrinio targedau craidd pellach.

2. 2. 5 EWCH, dadansoddiad KEGG

Defnyddiwch yr adran Anodiad Swyddogaethol yng nghronfa ddata DAVID i berfformio dadansoddiad cyfoethogi ar dargedau croestoriad clefydau cydrannol. Yn gyntaf gosodwch y paramedrau dadansoddi, nodwch y targed croestoriad yn y blwch Rhestr Genynnau, dewiswch symbol genyn swyddogol fel y dynodwr targed, dewiswch Rhestr Genynnau fel y math o ddata (Math o Restr), a dewiswch "Homo Sapiens (Rhywogaethau)" fel y ffynhonnell darged (Rhywogaethau). Hil)", dechreuwch y dadansoddiad ar ôl cadarnhau'r paramedrau dadansoddi, cael y canlyniadau dadansoddi GO a KEGG, ac yna defnyddiwch y llwyfan lluniadu ar-lein ImageGP i lunio'r diagram swigen o ganlyniadau dadansoddiad KEGG a GO. Mae meddalwedd Cytoscape 3.7.2 yn adeiladu'r gydran -darged-llwybr llun rhwydwaith.

2. 2. 6 Moecylaidd docio

Yn gyntaf lawrlwythwch y diagram strwythur 3D o'r cynhwysyn gweithredol mewn fformat SDF o gronfa ddata PubChem, yna lawrlwythwch y diagram strwythur 3D o'r targed croestoriad ar ffurf PDB o Gronfa Ddata Protein Byd-eang yr Unol Daleithiau (PDB), ac yn olaf ei uwchlwytho i'r CB-Dock gwefan ar gyfer tocio moleciwlaidd. Sgriniwch y cydffurfiadau tocio dominyddol a delweddwch nhw gyda Pymol.

2.3 Arbrofion anifeiliaid

2.3.1 Modelu, grwpio, a rhoi cyffuriau

Dewiswyd 10 o lygod mawr ar hap fel y grŵp arferol a'u bwydo â phorthiant cyffredin, a chafodd y llygod mawr sy'n weddill eu bwydo â phorthiant siwgr uchel a braster uchel. Ar ôl 6 wythnos, cawsant chwistrelliad mewnperitoneol un-amser o 30 mg/kg STZ (0. 1 mmol/L STZ hydoddi mewn byffer citrad sodiwm pH 4.5), a 72 awr yn ddiweddarach, cymerwyd gwaed o wythïen y gynffon. i ganfod glwcos gwaed ymprydio (FBG). Os yw FBG yn fwy na neu'n hafal i 16. 7mmol/L, sefydlwyd y model diabetes yn llwyddiannus [15]; parhau Cawsant eu bwydo â llawer o siwgr a braster uchel o borthiant am 2 wythnos. Penderfynwyd bod modelu DKD yn llwyddiannus yn seiliedig ar bositifrwydd glwcos wrin a 24-awr o brotein wrin cyfanswm (24-UTP) Yn fwy na neu'n hafal i 20 mg. Yn eu plith, bu farw 3 yn ystod y broses fodelu ac roedd 7 yn aflwyddiannus. , roedd cyfanswm o 50 yn llwyddiannus. Rhannwyd y llygod mawr a fodelwyd yn llwyddiannus ar hap i'r grŵp model, grŵp dapagliflozin (1 mg / kg), a grwpiau dos uchel, canolig ac isel CPhGs (500, 250, 125 mg / kg). Roedd pob grŵp gweinyddol yn cael ei weinyddu'n fewngastrig. Rhoddwyd cyffuriau cyfatebol i'r llygod mawr yn y grŵp arferol a'r grŵp model, a rhoddwyd yr un faint o halwynog arferol i'r llygod mawr yn y grŵp arferol a'r grŵp model trwy gavage, unwaith y dydd am gyfanswm o 6 wythnos. Yn ystod y cyfnod gweinyddu, parhawyd i roi porthiant braster uchel i lygod mawr ym mhob grŵp ac eithrio'r grŵp arferol.

2.3.2 Canfod Dangosyddion Biocemegol

Ar ôl 6 wythnos o ymyrraeth CPhG, 24-casglwyd wrin awr oddi wrth y llygod mawr, a mesurwyd 24-cyfanswm o brotein wrin (24-UTP) o awr); casglwyd gwaed o wythïen gynffon ymprydio i ganfod lefelau FBG; casglwyd gwaed o'r aorta abdomenol, 4 gradd , 1500 r/munud. Centrifuge am 10 munud i wahanu'r serwm a chanfod nitrogen wrea serwm.

BUN), asid wrig (UA), cyfanswm colesterol (TC), triglyserid (TG), lipoprotein dwysedd uchel (HDL), lefelau lipoprotein dwysedd isel (lipoprotein dwysedd isel LDL).

2.3.3 Arsylwi morffoleg patholegol meinwe arennol

Anestheteiddiwyd y llygod mawr â sodiwm pentobarbital a'u haberthu. Cafodd yr arennau eu plicio i ffwrdd, eu pwyso, eu gosod gyda 4% paraformaldehyde, dadhydradu, tryloyw, trochi mewn cwyr, wedi'u mewnosod, a'u torri i mewn ar gyfer staen hematocsilin-eosin (AU).

Ar ôl staenio Masson, arsylwyd morffoleg y meinwe o dan ficrosgop, a defnyddiwyd meddalwedd Image-Pro Plus 6.0 i ddadansoddi'r dwysedd optegol integredig a meintioli'r arwynebedd ffibr colagen cymharol.

2. 3. 4 ELISA

Defnyddiwyd y dull i ganfod lefelau ffactorau llidiol serwm mewn llygod mawr. Canfuwyd lefelau IL-6, IL-1 , a TNF- yn unol â chyfarwyddiadau'r pecyn.

2. 3. 5 Western blot dull i ganfod mynegiant protein cysylltiedig

Cymerwyd meinwe arennau llygod mawr, ychwanegwyd lysate RIPA i echdynnu cyfanswm y protein, a phenderfynwyd y crynodiad gan y dull BCA.

Ar ôl electrofforesis gel dodecyl dodecyl sulfate-polyacrylamide, trosglwyddo i bilen PVDF, ac ar ôl blocio, JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p-STAT3 (1:2000), SOCS3 (1:2000), -actin (1:2000) gwrthgyrff, deor ar 4 gradd dros nos, ychwanegu gwrthgorff eilaidd IgG â label HRP (1:5000), a deor ar dymheredd ystafell am 1 h, wedi'i ddatblygu gyda phecyn electroluminescence, yn agored. gan ddelweddwr gel protein, gan ddefnyddio meddalwedd Image J

Dadansoddiad meintiol o ddarnau. Gan ddefnyddio -actin fel y cyfeirnod mewnol, cymhareb gwerth llwyd y band targed a'r band cyfeirio mewnol yw'r mynegiant protein cymharol.

2.4 Dadansoddiad ystadegol

Proseswyd y data gan feddalwedd SPSS 25.0, a mynegwyd y data fel (x±s). Defnyddiwyd dadansoddiad un ffordd o amrywiant i gymharu rhwng grwpiau. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.