Haniaethol

Rhagymadrodd: Mae Propolis yn sylwedd naturiol resinaidd sy'n cael ei gasglu gan wenyn mêl o blagur ac ecsiwtadau o goed a phlanhigion amrywiol; derbynnir yn eang bod cyfansoddiad propolis yn dibynnu ar nodweddion ffytoddaearyddol y safle casglu.

Gall glycoside cistanche hefyd gynyddu gweithgaredd SOD ym meinweoedd y galon a'r afu, a lleihau'n sylweddol y cynnwys lipofuscin a MDA ym mhob meinwe, gan ysbeilio radicalau ocsigen adweithiol amrywiol (OH-, H₂O₂, ac ati) yn effeithiol a diogelu rhag difrod DNA a achosir. gan OH-radicaliaid. Mae gan glycosidau ffenylethanoid Cistanche allu chwilota cryf o radicalau rhydd, gallu lleihau uwch na fitamin C, gwella gweithgaredd SOD mewn ataliad sberm, lleihau cynnwys MDA, a chael effaith amddiffynnol benodol ar swyddogaeth pilen sberm. Gall polysacaridau cistanche wella gweithgaredd SOD a GSH-Px mewn erythrocytes a meinweoedd yr ysgyfaint llygod senescent arbrofol a achosir gan D-galactos, yn ogystal â lleihau cynnwys MDA a cholagen yn yr ysgyfaint a phlasma, a chynyddu cynnwys elastin, wedi effaith sborion dda ar DPPH, ymestyn amser hypocsia mewn llygod senescent, gwella gweithgaredd SOD mewn serwm, ac oedi dirywiad ffisiolegol yr ysgyfaint mewn llygod senescent arbrofol Gyda dirywiad morffolegol cellog, mae arbrofion wedi dangos bod gan Cistanche y gallu gwrthocsidiol da ac mae ganddo'r potensial i fod yn gyffur i atal a thrin clefydau heneiddio'r croen. Ar yr un pryd, mae gan echinacoside yn Cistanche allu sylweddol i ysbeilio radicalau rhydd DPPH a gallant ysbeilio rhywogaethau ocsigen adweithiol, atal diraddio colagen a achosir gan radical rhad ac am ddim, ac mae hefyd yn cael effaith atgyweirio da ar ddifrod anion radical rhad ac am ddim thymin.

Cliciwch ar Atodiad Cistanche Tubulosa

【Am ragor o wybodaeth: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Amcanion: Nod yr astudiaeth hon oedd pennu cyfansoddiad ffytocemegol darnau ethanolig o wyth swp propolis a gasglwyd mewn gwahanol ranbarthau o Benin (gogledd, canol a de) a Chongo, Affrica.

Deunydd a dulliau:Perfformiwyd nodweddu samplau propolis trwy ddefnyddio gwahanol ddulliau cromatograffig cysylltnod wedi'u cyfuno â dadfeiliad cyseiniant magnetig niwclear carbon-13 (13C NMR) â meddalwedd MixONat. Yna gwerthuswyd eu gweithgaredd cynnyrch terfynol gwrthocsidiol neu glyciad gwrth-uwch (gwrth-AGE) trwy ddefnyddio profion albwmin serwm diphenylpicrylhydrazyl a buchol, yn y drefn honno.

Canlyniadau: Dangosodd dadansoddiadau cromatograffig ynghyd â dadfeiliad NMR 13C fod dau sampl o ganol Benin wedi'u harddangos, yn ogystal â llawer iawn o driterpenau pentacyclic, stilbenoidau methocsylaidd neu phenanthrenes, sy'n gyfrifol am weithgaredd gwrthocsidiol y dyfyniad am yr un cyntaf. Yn eu plith, gallai combretastatin fod yn sytotocsig. Ar gyfer yr ail un, roedd y flavanones prenylated a oedd yn hysbys mewn propolis tebyg i Macaranga yn gyfrifol am eu gweithgaredd gwrth-AGE sylweddol. Roedd y sampl o'r Congo yn cynnwys llawer o ddeilliadau triterpene yn perthyn i rywogaethau Mangifera indica.

Casgliad: Felly, mae'n ymddangos bod propolis o ganol Benin o ddiddordeb arbennig, oherwydd ei briodweddau gwrthocsidiol a gwrth-AGE. Serch hynny, gan fod safoni propolis yn anodd mewn parthau trofannol oherwydd ei amrywiaeth chemo wych, mae angen dadansoddiad ffytocemegol systematig cyn hyrwyddo'r defnydd o propolis mewn cynhyrchion bwyd ac iechyd yn Affrica.

GEIRIAU ALLWEDDOL

dadfeiliad NMR 13C, stilbenoidau methocsylaidd neu ffenanthrenes, triterpenau pentacyclic, flavanones prenylated, Propolis

1. RHAGARWEINIAD

Mae Propolis yn sylwedd resinaidd naturiol sy'n cael ei gasglu gan wenyn o blagur a phlanhigion amrywiol goed a phlanhigion, wedi'i gymysgu â chwyr gwenyn ac ensymau poer.1 Fe'i defnyddir gan wenyn i amddiffyn y fynedfa rhag tresmaswyr, tyllau plwg, waliau mewnol llyfn, mymïo anifeiliaid marw (pryfed bach) y tu mewn i'r cwch gwenyn, a chydbwyso lleithder eithafol neu amodau sychder.2,3 Mae Propolis wedi'i ddefnyddio'n helaeth mewn meddygaeth werin ers yr hen amser oherwydd ei ystod eang o briodweddau therapiwtig.4 Mae Propolis yn gyffredinol yn cynnwys resin (50 y cant) , cwyr (30 y cant ), olewau (10 y cant ), paill (5 y cant ), a chyfansoddion ffenolig ychwanegol megis flavonoids.5,6 Gwyddys bod cyfansoddiad cemegol propolis yn gymhleth ac yn amrywio yn ôl rhywogaethau planhigion sy'n tyfu o amgylch y cwch gwenyn , y mae gwenyn yn casglu exudates ohono.7 Derbynnir bod sawl ffactor, megis cyfansoddiad blodeuol yr ardal, lleoliad ac amser casglu, y tymor, y math o gasglwr, argaeledd ac uchder, a'r gweithgaredd bwyd a ddatblygwyd yn ystod mae ecsbloetio'r propolis yn cael effaith ar gyfansoddiad cemegol y propolis.8,9 Mae yna wahanol fathau o propolis, yn dibynnu ar ardal ddaearyddol cynhyrchu, ffynhonnell botanegol, a chyfansoddiad cemegol. Y mathau mwyaf cyffredin o bropolis yw tymherus, bedw, trofannol, Môr y Canoldir, a'r Môr Tawel.10 Mae propolis o barthau hinsoddol tymherus, megis Ewrop, Gogledd America, neu ranbarthau nad ydynt yn drofannol yn Asia, yn dod yn bennaf o ecsodau blagur rhywogaethau Populus ( Salicaceae) ac felly mae'n gyfoethog mewn flavonoids ac asidau ffenolig a'u esterau; fodd bynnag, mae propolis trofannol, sy'n tarddu o ranbarthau lle nad yw poplys na bedw yn tyfu, yn gyfoethog mewn deilliadau prenylated o asidau p-coumaric, benzophenones, neu terpenoidau.11 Mae propolis y Môr Tawel, sy'n nodweddiadol gyfoethog mewn flavanones prenylated, yn fath pwysig arall o bropolis a geir yn Taiwan , Japan, ac Ynysoedd Solomon, a cheir propolis bedw yn benodol yn Rwsia.12 Mae astudio propolis o Asia drofannol wedi arwain at ddarganfod Macaranga denarius L. a Mangifera indica L. fel ffynonellau planhigion propolis Indonesia.13 Ar y llaw arall, rhywogaethau conwydd o'r teulu Cupressaceae yw prif ffynhonnell botanegol propolis yn rhanbarthau Môr y Canoldir.14 Datgelodd dadansoddiadau cemegol fod propolis yn cynnwys mwy na 300 o wahanol gynhyrchion naturiol (NPs), gan gynnwys deilliadau asid ffenolig, coumarins, flavonoids, sesquiterpenes, diterpenes, triterpenes, steroidau, lignans, neu benzophenones prenylated.15 Mae effeithiau biolegol propolis wedi'u disgrifio'n bennaf nid yn unig am eu gwrthocsidydd, 16-18 gwrth-OED (hy, ataliad o ffurfio cynnyrch terfynol glyciad uwch [AGE]),19 gwrth -inflammatories,20 ac effeithiau gwrth-tiwmor,21-23 ond hefyd eu gweithgareddau gwrthfacterol,24-26 gwrth-ffwngaidd,15 gwrth-feirysol,27 a gwrth-barasitig28. Gwyddys hefyd bod Propolis yn ysgogi cynhyrchu gwrthgyrff, gan awgrymu y gellir ei ddefnyddio fel cyffur cynorthwyol mewn brechlynnau.29 Mae'r defnydd cynyddol o'r sylwedd naturiol hwn o gyfansoddiad amrywiol ac felly amrywiol weithgareddau biolegol yn y diwydiannau fferyllol, cosmetig a bwyd yn creu diddordeb arbennig mewn ymchwil wyddonol, yn enwedig o ran diffinio ei gyfansoddiad cemegol. Mae'r rhan fwyaf o astudiaethau wedi'u cynnal ar samplau o Ewrop19,30–33 ac America Ladin, yn fwy penodol Brasil,20,23,34–36 tra mai ychydig o astudiaethau a gynhaliwyd yn Affrica.37–41 Mae gwybodaeth am bropolis Beninese a Congolese42 yn parhau i fod yn brin.

Felly, nod yr astudiaeth hon oedd nodweddu cyfansoddion mawr o samplau propolis a gasglwyd mewn parthau ffytoddaearyddol amrywiol o Benin a Congo (Affrica) gan ddefnyddio dad-ddyblygiad cyseiniant magnetig niwclear 13C (NMR) gyda meddalwedd MixONat.43,44 Astudiaeth ragarweiniol gan ddefnyddio cronfa ddata (DB) sy'n cynnwys Ni roddodd NPs a adroddwyd yn flaenorol o propolis ynghyd â'u sifftiau cemegol rhagweledig 13C (δC) unrhyw ddata defnyddiadwy o gymharu â'r canlyniadau boddhaol a geir fel arfer gyda echdynion planhigion.43–45 Gellir esbonio hyn gan gyfansoddiad cemegol propolis, sy'n ddibynnol iawn ar y fflora lleol, gan ei gwneud hi'n amhosibl adeiladu DB cemotaxonomig. Felly, i ddehongli cyfansoddion mawr o bropolis Beninese a Congolese, yn y gwaith presennol fe wnaethom berfformio cromatograffaeth hylif perfformiad uchel ynghyd â sbectrometreg màs canfod gwasgariad golau uwchfioled ac anweddol (HPLC-UV-ELSD-MS) a chromatograffeg nwy ynghyd â sbectrometreg màs ( GC-MS) yn dadansoddi echdynion propolis crai i nodi eu prif nodweddion strwythurol ac adeiladu DBs cyfatebol o NPs sy'n addas ar gyfer meddalwedd MixONat.46 Yna, ar ôl ffracsiynu bras o'r samplau propolis a ddewiswyd yn ôl eu proffil cemegol, caniateir dad-ddyblygu 13C yn seiliedig ar NMR nodi NPs mawr heb eu puro ymhellach. Cynhaliwyd profion gwrthocsidiol a gwrth-AGE hefyd.

2. GWEITHDREFNAU ARBROFOL

2.1 Cemegau

Prynwyd 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), adweithydd Folin-Ciocalteu, asid fformig, ac asid galig, sydd i gyd yn radd ddadansoddol, gan Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Ffrainc). Roedd 6-Hydroxy-2,- 5,7,8-tetramethylchroman-2-asid carbocsilig (Trolox®) ac 50 - asid caffeoylquinig (asid clorogenig) yn a gafwyd gan Acros Organics (Geel, Gwlad Belg).

2.2 Samplau Propolis

Casglwyd wyth sampl propolis Beninese trwy grafu o gychod gwenyn mewn tri pharth ffytoddaearyddol (Tabl 1 a Ffigur SI-1). Casglwyd sampl o bropolis Congolese yn y goedwig artiffisial o goed acacia ar lwyfandir Bateke yng nghanol Gweriniaeth y Congo (Tabl 1).

2.3 Echdynnu Propolis

Paratowyd echdynion ethanolig o bropolis (EEPs) i ddechrau gan ddefnyddio'r protocol echdynnu canlynol.19 Cafodd propolis amrwd ei falurio'n homogenaidd gyntaf ym mhresenoldeb nitrogen hylifol. Ar gyfer pob sampl, cafodd 1 g o bowdr propolis ei friwio mewn 20 ml o 95 y cant EtOH. Ar ôl ei droi am 2 h ar dymheredd yr ystafell, cafodd y gymysgedd ei hidlo gan ddefnyddio hidlydd twndis disg gwydr sintered (maint mandwll 16-40 μm). Cafodd y gweddillion eu hail-echdynnu ddwywaith gan ddefnyddio'r un camau. Yna, cafodd y tair hidlydd a gasglwyd eu cynnal ar 18 C dros nos, eu hidlo i gael gwared â chwyrau, a'u hanweddu o dan bwysau llai (40 C, 10 bar) i roi'r EEPs.

Echdynnwyd symiau o 8.0 g o bowdr propolis o BC1 (1) a BC2 (2) neu 10.3 g o CG (3) eto gydag EtOH 95 y cant (UAE, 4 80 ml, 15 mun) am ragor cromatograffaeth fflach.

2.4 Pennu cyfanswm y cynnwys ffenolig

Pennwyd cyfanswm y cynnwys ffenolig trwy ddull lliwimetrig Folin-Ciocalteu fel y disgrifiwyd yn flaenorol,19 ac fe'i haddaswyd yn ddiweddar i'w ddefnyddio'n uniongyrchol mewn microblatiau. Yn gryno, 10 ul o bob dyfyniad propolis yn MeOH (3.5 mg/ml ar gyfer BC1, 5 mg/ml ar gyfer BN2, BC2, a CG, 7.5 mg/ml ar gyfer BN1, BS1a, BS1b, a BS2, ac Cymysgwyd 10 mg/ml ar gyfer BS3) â 20 ul o ddŵr distyll a 10 ul o adweithydd Folin-Ciocalteu mewn 96-microplate ffynnon. Ar ôl 3 munud, ychwanegwyd 120 ul o ddŵr distyll a 40 ul o 20 y cant o sodiwm carbonad dyfrllyd. Mesurwyd yr amsugnedd ar sbectrophotometer microplate TECAN® (V6.5) ar 760 nm ar ôl 30 munud yn y tywyllwch ar dymheredd ystafell. Paratowyd gwag yn yr un modd trwy ddefnyddio MeOH yn lle'r hydoddiant echdynnu a defnyddiwyd asid galig i gyfrifo'r gromlin raddnodi (0.04–0.328 mg/ml; y=2.7241x 0.0039; r2=0 .9982). Dadansoddwyd pob sampl yn driphlyg. Mynegwyd cyfanswm y cynnwys ffenolig yn nhermau cyfwerth ag asid galig (mg) fesul gram o echdyniad (mg GAE/g).

2.5 Dadansoddiadau cromatograffig rhagarweiniol

2.5.1 TLC dadansoddol

Perfformiwyd cromatograffaeth haen denau ddadansoddol (TLC) ar TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, yr Almaen), gan ddefnyddio cymysgedd o cyclohexane: AcOEt fel eluant. Delweddwyd smotiau yn y cromatogram yn gyntaf o dan olau UV (254 nm) ac yna trwy chwistrellu ag adweithydd asid vanillin-sylffwrig (2 ml o asid sylffwrig crynodedig mewn 98 ml o hydoddiant ethanol 1:99 w/v vanillin: 95 y cant) a gwresogi'r cromatogramau i 110 gradd C am 5 munud.

2.5.2 Gweithdrefn GC-MS

Perfformiwyd dadansoddiad GC-MS ar samplau heb eu deillio gan ddefnyddio Chromatograff Nwy Shimadzu GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Ffrainc) gyda foltedd ïoneiddiad o 70 eV (Electronig Effaith). Paratowyd samplau mewn dichloromethane (DCM) ar 2 mg/ml ar gyfer echdynion ac 1 mg/ml ar gyfer ffracsiynau. Gwnaed gwahaniadau gan ddefnyddio colofn ZB5 Phenomenex (30 m * 0.250 mm diamedr mewnol gyda thrwch ffilm 0.25 mm; Phenomenex, Le Pecq, Ffrainc). Roedd y tymheredd wedi'i raglennu fel a ganlyn: 180 gradd C (3 munud), 180-280 gradd C ar gyfradd o 10 C / mun, a 280 gradd C (27 munud). Defnyddiwyd heliwm fel nwy cludo ar gyfradd llif o 2.0 ml/munud. Gosodwyd tymheredd chwistrellwyr a synhwyrydd ar 250 gradd C a 280 gradd C, yn y drefn honno. Nodwyd metabolion trwy gymharu eu hamseroedd cadw (Rt), màs enwol, a / neu batrymau darnio â rhai samplau dilys a / neu'r rhai a gynhwysir yn llyfrgelloedd patrwm darnio'r offer (NIST11, NIST11s, a FFNSC2).

2.5.3 Gweithdrefn HPLC-DAD-ELSD

Cynhaliwyd dadansoddiadau cromatograffig gan ddefnyddio cromatograff hylif 3D Shimadzu 2030C (Noisiel, Ffrainc) wedi'i gyfarparu ag arae deuod.synhwyrydd (DAD) ac ELSD (Sedere®) gyda cholofn Lichrospher® 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, yr Almaen ) wedi'i warchod â chetris gard Lichrocart® 4-4 (4 mm * 4 mm id), gan ddefnyddio cyfradd llif o 1 ml/munud. Roedd y cyfnod symudol yn cynnwys 0.1 y cant o asid ffurfig mewn dŵr (toddydd A) a methanol (toddydd B), a pherfformiwyd gwahaniad gan y graddiant llinol canlynol: 25-100 y cant B (0-40 mun), 100 y cant (40-45 min). Cofnodwyd sbectra UV-vis yn yr ystod o 190-600 nm, a chaffaelwyd cromatogramau ar 254 a 280 nm. Cynheswyd ELSD ar 30graddC, a chymhwyswyd cynnydd o 4 i'r signal. Paratowyd samplau mewn crynodiad o 10 mg / ml yn MeOH a'u centrifugio ar 13,000 g am 10 munud cyn y pigiad (10 ul) i gael gwared ar olion deunyddiau crog.

2.5.4 Gweithdrefn HPLC-UV-MS

Perfformiwyd dadansoddiadau HPLC-UV-MS gan ddefnyddio modiwl gwahanu 2795 Waters (Guyancourt, Ffrainc) gyda synhwyrydd λ 2487 Waters Dual. Roedd y golofn, y cyfnodau symudol a'r graddiant yr un fath â'r rhai a ddisgrifir uchod ar gyfer HPLC-DAD-ELSD. Cafwyd cromatogramau ar 254 a 280 nm. Cynhaliwyd y dadansoddiadau màs ar ïoneiddiad electrochwistrellu Bruker (Bremen, yr Almaen) / ïoneiddiad cemegol gwasgedd atmosfferig (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plws mewn moddau positif a negyddol fel a ganlyn: nwy gwrthdrawiad, He; osgled egni gwrthdrawiad, 1.3 V; nebulizer a nwy sychu, N2, 7 L/mun; pwysedd nwy nebulizer, 30 psi; tymheredd sych, 340 C; cyfradd llif, 1.0 ml/munud; cymhareb hollti toddyddion, 1:9; ystod sgan, m/z 100–1,000. Paratowyd samplau mewn crynodiad o 10 mg/ml yn MeOH, eu centrifugio ar 13,000 g am 10 munud, a'u hidlo trwy hidlydd chwistrell bilen polytetrafluoroethylene (PTFE) 0.{{27} μm cyn pigiad (20 ul) i gael gwared ar olion o ddeunyddiau crog.

2.6 Ffracsiwn EEP yn ôl cromatograffaeth fflach

Yn gyntaf, diddymwyd 3.8 go BC1 (1), 3.5 go BC2 (2), neu 4.0 g o CG (3) EEPs mewn cyfaint lleiaf posibl o DCM ac aseton a'i gymysgu â gel silica (silica gel: cymhareb echdynnu, 2:1). Ar gyfer pob un ohonynt, caniatawyd i'r toddydd anweddu nes cael powdr sych mân. Ar gyfer pob EEP, perfformiwyd ffracsiynu wedyn trwy ddefnyddio cyfarpar CombiFlash Teledyne ISCO (Lincoln, NE, USA) gyda cholofn gel silica (Chromabond® Flash RS 4{{2{0}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, Ffrainc) ar gyfradd llif o 25 ml/munud gyda cyclohexane (hydoddydd A) ac asetad ethyl (EtOAc) (toddydd B) gan ddefnyddio'r elution graddiant canlynol: (1) ar gyfer BC1 EEP, 5 y cant B (0–10 mun), 5–20 y cant B (10–30 mun), 20–30 y cant B (30–60 mun), 30–50 y cant B (60–85 mun), a 50–100 y cant B (85–110 mun); Casglwyd 160 o diwbiau o 20 ml a'u cyfuno'n 14 ffracsiynau (BC1_F1 i BC1_F14) ar sail eu proffiliau cromatograffig TLC (cymhareb cyclohexane:EtOAc, 90:10 i 50:50 ); (2) ar gyfer BC2 EEP, 5 y cant B (0–10 mun), 5–10 y cant B (10–20 mun), 10–30 y cant B (20–40 mun), 30–40 y cant B (40–55 munud). mun), a 40–100 y cant B (55–70 mun); Casglwyd 100 tiwb o 20 ml a'u cyfuno'n 8 ffracsiwn (BC2_F1 i BC2_F8) ar sail eu proffiliau cromatograffig TLC (cymhareb cyclohexane:EtOAc, 90:10 i 60:40 ); (3) ar gyfer CG EEP, 5 y cant B (0–10 mun), 5–10 y cant B (10–30 mun), 10–20 y cant B (30–50 mun), 20–40 y cant B (50–70 munud). mun), 40–60 y cant B (70–80 mun), a 60–100 y cant B (80–90 mun); Casglwyd 135 o diwbiau o 20 ml a'u cyfuno yn 23 ffracsiynau (CG_F1 i CG_F23) ar sail eu proffiliau cromatograffig TLC (cymhareb cyclohexane:EtOac, 80:20 i 60:40 ).

Perfformiwyd cam ffracsiynu ychwanegol ar y ffracsiwn BC{{18F7: cafodd 200 mg ei hydoddi mewn cyfaint lleiaf posibl o MeOH a'i gymysgu â gel silica C{{{{{{}}}(C18-silica gel: cymhareb echdynnu, 2:1). Gwireddwyd gwahaniad ar golofn C18 (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, Ffrainc) ar gyfradd llif o 15 ml/munud gyda dŵr (toddydd A) a MeOH (toddydd B) gan ddefnyddio'r elution graddiant canlynol: 50– 70 y cant B (0-30 mun) a 70-100 y cant B (30-40 mun); Casglwyd 80 tiwb o 8 ml a'u cyfuno'n 5 ffracsiwn (BC2_F7-1 i BC2_F7-5) yn seiliedig ar eu proffiliau HPLC-UV (280 nm) .

2.7 1 dadansoddiadau NMR H a 13C

Roedd sbectra NMR (1D a 2D) o ffracsiynau propolis (7-58 mg) neu weithiau NPs yn cael eu cofnodi mewn clorofform deuterated (CDCl3) neu methanol deuterated (CD3OD) (500 ul) ar sbectromedr JEOL NMR ar 400 MHz ar gyfer 1 H a 100 MHz ar gyfer 13C. Perfformiwyd arbrofion NMR (1 H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90, a 2D NMR) ar ffracsiynau a NPs pur ar 298 K ar sbectromedr JEOL 400 MHz H (JEOL Europe, Croissy -sur-Seine, Ffrainc) â phrob gwrthdro 5-mm (ROYAL RO5). Mynegir sifftiau cemegol (δH a δC) mewn gwerthoedd ppm a J mewn Hz.

Ar gyfer sbectra 13C NMR (100 MHz), defnyddiwyd dilyniant datgysylltu WALTZ-16 gydag amser caffael o 1.04 s (32,768 pwynt data cymhleth) ac oedi ymlacio o 2 s. Rhwng 1,500 ac 11,000 sganiau eu casglu i gael cymhareb S/N foddhaol. Cymhwyswyd hidlydd ehangu llinell esbonyddol 1 Hz ar bob pydredd ymsefydlu am ddim (FID) cyn y trawsnewidiad Fourier. Cafodd sbectra eu cyflwyno fesul cam a'u cywiro llinell sylfaen gan ddefnyddio meddalwedd MestReNova (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Sbaen) a chyfeiriwyd at gyseiniant canolog y toddydd deuterated yn δC 77.16 ppm (CDCl3) a δC 49.00 ppm (CD3OD). Ar gyfer gwelliant di-ystum gan arbrofion trosglwyddo polareiddio (DEPT), roedd angen rhwng 512 a 5,500 o sganiau a gwnaed aliniadau â'r sbectra 13C gan ddefnyddio δC penodol. Yna defnyddiwyd trothwy dwysedd lleiaf i gasglu signalau 13C NMR a DEPT{-90 positif a signalau DEPT{-135 positif a negyddol â llaw, gan osgoi arteffactau sŵn posibl.

Adeiladwyd Propolis DB1 yn gyntaf trwy chwilio am gyfansoddion a ddisgrifir yn propolis ar SciFindern, 47 gan arwain at DB o 1,471 NPs; Rhagfynegwyd gwerthoedd δC gan ddefnyddio rhagfynegyddion NMR (C, H) Datblygiad Cemeg Uwch (ACD). O DBs o'r fath sy'n cynnwys NPs ynghyd â'u gwerthoedd δC-SDF, creodd y drefn CTypeGen a gynhwyswyd yn MixONat DB addas: Darllenodd y ffeil data gofodol (SDF) a didoli sifftiau cemegol yn ôl math o garbon. Yna crëwyd y SDF math c gofynnol, hy, math c Propolis DB1.43,44

Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 ei greu. Roedd chwiliad o sylweddau gan ddefnyddio'r geiriau allweddol stilbenoids a phenanthrenes yn y LOTUS DB yn cynnwys 276,518 NPs48 (LOTUS, 2022) yn caniatáu cael Stilbenoids _Phenanthrenoids DB2 o 2,681 NPs fel SDF. Yna crëwyd Flavanones DB3: Chwiliad ar SciFindern47 gan ddefnyddio'r 2-phenylchroman-4-un is-strwythur a ganiateir i ddewis o 56,679 o foleciwlau. Fe'u gostyngwyd ymhellach i 2,893 gan gyfeirio at "Digwyddiad cynhyrchion naturiol" gan ddefnyddio dadansoddiad o'r sylweddau gyda'r hidlydd "Rôl Gyfeirio" a gynigiwyd gan SciFindern. Ar ôl mireinio ychwanegol trwy gam hidlo yn seiliedig ar y pwysau moleciwlaidd disgwyliedig (MW) (hy, 340 i 424 Da), cafodd yr holl flavanones perthnasol eu hallforio wedyn fel SDF i gael y NPs o Flavanones DB3 (684 NPs). Ar gyfer pob NPs o DB2 a DB3, rhagwelwyd gwerthoedd δC-SDF gan ddefnyddio meddalwedd rhagfynegwyr ACD NMR (C, H) yn ogystal â'r fethodoleg a ddisgrifiwyd yn flaenorol gan Nuzillard46 i gael y SDF math c yn uniongyrchol yn barod i'w ddefnyddio gan MixONat. Mae'r olaf yn cynnwys ar gyfer pob cyfansoddyn o'r DB y gwerthoedd δC a ragwelir wedi'u trefnu fel methyl, methylene, methine, neu garbonau cwaternaidd.

Adeiladwyd Triterpenes DB4 o'r PNMRNP3 DB49,50 a fewnforiwyd fel SDF mewn meddalwedd rhagfynegwyr ACD NMR (C, H) trwy chwilio triterpenes gyda MW rhwng 100 a 500 Da (hy, data Chwilio: triterpenes; Chwilio MW: 100 i 500) i gael DB yn uniongyrchol o 6,623 triterpenes yn y fformat ffeil math-c gofynnol.

Adeiladwyd deilliadau alc(en)yl resorcinol a ffenol DB5 o'r PNMRNP3 DB49,50 a fewnforiwyd fel SDF mewn meddalwedd rhagfynegyddion NMR ACD (C, H) trwy chwilio NPs gyda sgaffald ffenol m-alk(en)yl a'u dosbarthu fel ffenolau (hy, 3-(hexadec-8-en-1-yl)phenol Substructure search; Search Classyfire class: ffenol) i gael DB yn uniongyrchol o 44 NPs yn y fformat ffeil math-c gofynnol.

2.8 13C dadfeiliad ar sail NMR gan ddefnyddio meddalwedd MixONat

Allforiwyd y rhestr brig a data dwyster a gafwyd o bob sbectrwm arbrofol (13C NMR, DEPT-135, a DEPT-90) fel . csv yn defnyddio meddalwedd Microsoft Excel (Microsoft 16.45) ac yn cael ei ddefnyddio fel ffeil fewnbwn ym meddalwedd MixONat. Mae ffeiliau o'r fath yn cynnwys rhestr o werthoedd δC a drefnwyd mewn trefn ostyngol sy'n gysylltiedig â'u dwyster ar yr un llinell, wedi'u gwahanu gan goma.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Wedi hynny, cymharwyd data arbrofol NPs â'r sgorau gorau â'r llenyddiaeth.

2.9 Puredigaeth

2.9.1 HPLC Paratoadol

Cyflawnwyd puro ffracsiynau BC{{{0}}F6 a BC1_F8 (40 mg mewn 2 ml o MeOH) gan ddefnyddio paratoad Shimadzu LC-20AP cromatograff hylif wedi'i gyfarparu â synhwyrydd UV-vis SPD-40 (Noisiel, Ffrainc), dolen chwistrellu o 2 ml, a chasglwr ffracsiwn FRC-10A, gan ddefnyddio colofn baratoadol C18 (25{{39) }} mm 21.2 mm id, 5 μm) (Ymlid XRs 5, Agilent, Les Ulis, Ffrainc) ar gyfradd llif o 21.24 ml/ mun. Roedd y cyfnod symudol yn cynnwys 0.1 y cant o asid ffurfig mewn dŵr (hydoddydd A) a methanol (toddydd B) a pherfformiwyd y gwahaniad gan ddefnyddio'r graddiant canlynol: (1) ar gyfer BC{1_F6, 40 y cant B (0–5). mun), 40–70 y cant B (5–20 mun), a 70–90 y cant (20–30 mun); (2) ar gyfer BC1_F8, 40–70 y cant B (0–15 mun) a 70–90 y cant (15-25 mun). Cafwyd cromatogramau ar 254 a 280 nm.

2.9.2 Echdynnu cyfnod solet (SPE)

I gael y ffracsiwn mwyaf pegynol o BC2-EPP (200 mg mewn 5 ml o MeOH wedi'i gymysgu â 350 mg o gel silica C{18- ar ôl anweddiad), cyflawnwyd y puro gan ddefnyddio colofn echdynnu cyfnod solet C18 (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, Ffrainc) gyda dŵr: MeOH 7:3 (10 ml) a dŵr: MeOH 6:4 (10 ml). Cyfunwyd tiwbiau 4–10 i ffurfio ffracsiwn pegynol BC2 (BC2_SPE) yn seiliedig ar eu proffiliau HPLC-UV (330 nm).

2.10 Profion gwrthocsidiol a gwrth-AGE

2.10.1 Chwilota radicalau DPPH

Perfformiwyd gwerthusiad sborion radical DPPH o EEPs Beninese fel y disgrifiwyd yn flaenorol.51 Yn gryno, cafodd samplau a brofwyd eu gwanhau mewn EtOH absoliwt ar 0.02 mg/ml o doddiannau stoc ar 1 mg/ml mewn dimethylsulfoxide (DMSO). Rhoddwyd aliwquots (100 ul) o'r hydoddiannau gwanedig hyn mewn 96-platiau ffynnon yn driphlyg. Ychwanegwyd tua 25 ul o doddiant DPPH wedi'i baratoi'n ffres (1 mM) at 75 ul o EtOH absoliwt gan ddefnyddio chwistrellwr y darllenydd microplate (Infinite® 200, Tecan, Ffrainc) i gael cyfaint terfynol o 200 ul y ffynnon. Ar ôl 30 munud yn y tywyllwch ar dymheredd amgylchynol, penderfynwyd ar yr amsugnedd ar 517 nm. Defnyddiwyd EtOH fel gwag, tra defnyddiwyd hydoddiannau 10, 25, 50, a 75 μM o Trolox (analog hydroffilig -tocopherol) ar gyfer y gromlin graddnodi. Defnyddiwyd sampl o hydoddiant ethanolig asid clorogenig (0.02 mg/ml) fel y safon rheoli ansawdd. Mynegwyd canlyniadau fel cyfwerthoedd Trolox (micromolau TE fesul g o echdyniad).

2.10.2 Assay Gwrth-AGE

Penderfynwyd ar effeithiau echdynion propolis a'r pum prif ddeilliad naringenin ynysig ar ffurfiant AGE fel y disgrifiwyd yn flaenorol.51 Yn gryno, cafodd albwmin serwm buchol (BSA) (10 mg/ml) ei ddeor â D-ribose ({{). 13}}.5 M) ynghyd â'r cyfansawdd a brofwyd (3 μM i 3 mM) neu echdyniad (1 ug i 1 mg) mewn byffer ffosffad 50 mM ar pH 7.4 (NaN3, 0.02 y cant). Cafodd datrysiadau eu deor mewn 96-blatiau microtiter ffynnon ar 37 gradd C am 24 awr mewn system gaeedig cyn mesur fflworoleuedd AGE. Tynnwyd fflworoleuedd o'r sampl deoredig mewn amodau unfath heb D-ribose ar gyfer pob mesuriad. Fel Pentosidine (cyffro ar 335 nm, allyriadau ar 385 nm) Mesurwyd fflworoleuedd AGE gan fflworometreg.52 Diffiniwyd gwerthoedd IC50 fel faint o echdyniad (ug / ml) neu reolaeth gadarnhaol (μM) sydd ei angen i leihau ffurfiant OEDRAN 50 y cant mewn perthynas â'r rheolaeth negyddol. Yn ôl y asesiad dilysu ystadegol,53 mae un dadansoddiad yn ddigon ar gyfer penderfyniad IC50 cywir.

3. CANLYNIADAU A TRAFODAETH

3.1 Proffilio cromatograffig

Dangosodd proffilio LC cyffredinol o'r wyth Beninese a'r Congolese EPP gan ddefnyddio'r synhwyrydd ELSD lled-gyffredinol fod pob sampl yn cynnwys cyfansoddion am-begynol, wedi'u hegluro ar ddiwedd y cromatogramau (Ffigur 1). Cyflwynodd BC1 hefyd lawer iawn o fwy o gyfansoddion pegynol, ac arddangosodd BC2 rai cyfansoddion pegynol canolig mewn symiau llai. Roedd yn ymddangos bod cyfansoddion an-begynol yn CG EEP yn dra gwahanol i rai Beninese.

Felly, arweiniodd proffilio ELSD at dri sampl gwahanol a gwreiddiol yr ymchwiliwyd i'w cyfansoddiad ymhellach: BC1, BC2, a CG.

Yn gyntaf, cynhaliwyd dadansoddiadau GC-MS, gan gymharu'r darniad MS gyda'r NIST DB, i nodweddu'r dosbarthiadau cemegol a, lle bo'n bosibl, i nodi'r cyfansoddion. Cyflwynir dynodiad tybiannol (yn seiliedig ar ganran y paru â'r NIST DB) a dosbarthiadau cemegol o gyfansoddion yn Nhabl 2 (dangosir data proffilio cyfanswm cerrynt ïonig [TIC] GC yn Ffigur SI-2).

Cyflwynodd pob EEP Beninese yr un proffiliau o gyfansoddion nad ydynt yn begynol, wedi'u labelu fel llythyren A i F, ond gallai eu symiau amrywio. Fe'u nodwyd yn ôl pob tebyg fel - neu -amrinone (A), -amyrin (B), lupenone (C), -amyrin (D), - neu -amyrin asetad (E), a lupeol asetad (F) (cf. Ffigur SI -3), a ddisgrifiwyd eisoes fel NPs mawr yn propolis Mecsicanaidd.54 Zhang et al. (2014) a Tamfu et al. (2020) hefyd yn disgrifio triterpenoidau fel amyrin / lupeol ac asetadau amyrin / lupeol mewn amrywiol samplau propolis Affricanaidd.41,55 Dim ond BC1 a gyflwynodd NPs ychwanegol yn aneglur rhwng Rt 10 a 15 munud a awgrymwyd fel stilbenoidau methocsylaidd neu ffenanthrenes yn ôl eu patrymau darnio. Roedd yr EEP Congolese yn arddangos proffil gwahanol i'r rhai Beninese, gydag esters ethyl asid C16 a C18 fel cyfansoddion mwy anweddol yn gysylltiedig â sgôr cyfateb dda o 94 y cant , deilliad ffenol yn Rt 13.1 min, tri deilliad resorcinol yn yr ystod o 14 - 17 mun, a gwahanol fathau o ddeilliadau triterpene ar ôl Rt 21 mun.

Yn ogystal, dadansoddwyd EPPs gan HPLC-DAD-MS i ddelweddu NPs anweddol (gweler Ffigur SI-4). Dangosodd y proffilio gwahanol fod BC1 EEP yn arddangos llawer iawn o gyfansoddion pegynol canolig gyda chromophores yn amsugno ar 280 nm, yn ogystal â BC2 mewn cyfrannau llai, ac roedd gan CG broffil UV gwael iawn ar 280 nm.

3.2 Cyfansoddiad cemegol BC1 a BC2

Er mwyn nodi eu prif NPs gan ddefnyddio dadfeiliad NMR 13C yn seiliedig ar MixONat a DBs addas, cyflawnwyd ffracsiynu bras o BC1 a BC2 EEP gan gromatograffeg fflach. Yn wir, ar gyfer BC1, datgelodd dadansoddiad GC-MS bresenoldeb stilbenoidau methocsylaidd neu ffenanthrenes, a'n harweiniodd i adeiladu'r Stilbenoids _Phenanthrenoids DB2 penodol. Ar gyfer BC2, ac eithrio'r cyfansoddion mwy pegynol yn Rt 3.8 min, dangosodd pob cyfansoddyn sbectra UV o flavanones-dihydro flavonols, a awgrymodd greu'r Flavanones DB3.

Fel y dangosir yn Nhabl 3, awgrymwyd dihydrophenanthrenes 1 a 3-5, phenanthrenes 2 a 6, a'r dihydro stilbene 7 (Ffigur 2) yn BC1 EEP gan MixONat a'u dilysu trwy gymharu â data llenyddiaeth (cf. gwybodaeth ategol). Pan oedd angen, defnyddiwyd hidlydd MW yn seiliedig ar ddata HPLC-MS.

Yn fwy manwl gywir, ymhlith 9,10-deilliadau dihydrophenanthrene allan o 2,681 NPs yn DB2, awgrymodd MixONat 6-methoxycoelonin (2,7-dihydroxy{8}},5-dimethoxy{). {10}},10-dihydrophenanthrene; 3, safle 1, sgôr 0.75, Ffigurau SI-13 a SI-14) yn BC{{ 18}}Cadarnhawyd F5 a’i bresenoldeb trwy gymharu â data NMR cyhoeddedig. Mae wedi'i nodi eto o rywogaethau Combretaceae56 ac yn y tegeirian Bulbophyllum vaginatum; 57 a 2,7-dihydroxy-3,4,6-trimethoxy- 9,10-dihydrophenanthrene (4, safle 1, sgôr 0.88, Ffigurau SI{{33) }} a SI-16) wedi'i ddamcaniaethu yn BC1_F2. Disgrifiwyd Cyfansoddyn 4 eisoes yn propolis Senegal58 a dilyswyd ei bresenoldeb yn seiliedig ar ddata a adroddwyd gan Pettit et al. o'r goeden Affricanaidd Combretum caffrum59 a chan Lu et al. o Dioscorea nipponica Makino.60

Roedd y broses ddad-ddyblygu 13C ar sail NMR hefyd yn rhagweld 2,6-dihydroxy-3,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene (5, safle 8, sgôr) 0.76, Ffigurau SI-15 a SI-16) yn CC1_F2 a 2,6,7-trihydroxy{{20) }},4-dimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene (1, rheng 2, sgôr 0.5, Ffigurau SI-5 a SI-6 ) yn BC{{30}}F6-1 pan ddefnyddiwyd hidlydd moleciwlaidd ar MW 288 Da. Ar gyfer 1, roedd y sgôr yn eithaf isel (0.5); felly, roedd arbrofion NMR 2D ychwanegol (cydberthynas cwantwm lluosog heteroniwclear [HMQC], cysylltedd aml-bond heteroniwclear [HMBC], sbectrosgopeg effaith Overhauser niwclear [NOESY], gweler Ffigurau SI-7–SI-10) perfformio i gadarnhau'r strwythur; ar gyfer 5, roedd y sgôr yn 0.76, hy, yn uwch na 0.70. Cafodd y ddau NP (1 a 5) hyn eu crybwyll gyntaf gan Letcher et al. mewn rhywogaethau Combretum61,62 ac 1 eisoes wedi'i ganfod yn Senegalese propolis.58

Ymhlith deilliadau ffenanthrene, damcaniaethodd MixONat 2,6,7-trihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene (2, safle 1, sgôr 0.88, Ffigurau SI-11 a SI{{1{0}}) yn BC1_F8-1, a gadarnhawyd drwy gymharu â'i ddata sbectrol a ddisgrifiwyd gan Letcher et al. yn Combretum apiculatum. 61 2,7-Dihydroxy-3,4,6-trimethoxyphenanthrene (6, safle 5, sgôr 0.94, Ffigurau SI-17 a SI-18) awgrymwyd yn flaenorol ynysu oddi wrth Photolida Chinensis63 yn BC1_F4.

Awgrymwyd Combretastatin B{{0} (7), sef dihydro stilbene, gan MixONat yn y rheng gyntaf (sgôr 1.0, Ffigurau SI-17 a SI-19) yn BC1 EPP wrth ddefnyddio hidlydd MW (MW 304 Da) a'i ddilysu trwy gymharu â data NMR a ddisgrifiwyd gan Pettit et al. yn Combretum caffrum. 59

Mae cyfansoddion 2, 6, a 7 eisoes wedi'u nodi yn propolis Senegalese.58

Mae data NMR 1 H a 13C o 1–7 ar gael yn y wybodaeth ategol.

Ar gyfer BC2, nodwyd saith cyfansoddyn yn perthyn i ddau ddosbarth strwythurol o polyffenolau, deilliadau cromone-C-glucoside a prenylflavanone (8-14), a disgrifiwyd rhai ohonynt am y tro cyntaf yn propolis (Ffigur 3).

Ni roddodd y broses 13C yn seiliedig ar NMR gan ddefnyddio MixONat a DB1 i DB5 ganlyniadau perthnasol yn awgrymu NPs gwreiddiol. Nodweddwyd dau brif gynnyrch (8–9) yn llawn fel cymysgedd gan ddefnyddio sbectra màs a data NMR 1D a 2D (1 H, 13C, HMQC, HMBC, gweler Ffigur SI-20–SI-23) a nodwyd fel florin (8) ac isobiflorin (9), dau chromanone-Cglucosides a ddisgrifiwyd o'r newydd yn propolis, a ddisgrifiwyd yn flaenorol yn Pancratium biflorum64 ac ewin o Eugenia caryophyllata, yn y drefn honno.65

O ran deilliadau flavanone, ymhlith 688 NPs yn DB3, cynigiodd MixONat 6-prenylnaringenin (10, safle 1, sgôr 0.95, Ffigurau SI- 24 a SI{{8} }}) a ddisgrifiwyd eisoes ym mhropolis coch Nigeria66 yn CC{{10}}F7-1. 6,8-Diprenylaromadendrin (12, safle 1, sgôr 1.0, Ffigurau SI-28 a SI-29) a 6,8-diprenylnaringenin (lonchocarpol A ) (13, safle 10, sgôr 0.84, Ffigurau SI-30 a SI-31), a ddarganfuwyd yn flaenorol mewn samplau propolis Camerŵn,42 wedi'u dilysu yn BC2_F{ {30}} a BC2_F5, yn y drefn honno. 6-Damcaniaethwyd a chadarnhawyd Geranylnaringenin (14, safle 1, sgôr 0.84, Ffigurau SI-32 a SI-33), a ddisgrifiwyd yn flaenorol mewn propolis o Ynysoedd Solomon,67 yn CC{{41 }}F7-5. Yn olaf, awgrymwyd 6-naringenin dimethylallyl (11) yn yr ail safle gan MixONat yn BC2_F6 (rheng 2, sgôr 0.65, Ffigurau SI-26 a SI- 27). Cynigiwyd yr isomer yn safle 8 yn y safle cyntaf, ond dangosodd cymhariaeth â data llenyddiaeth 68,69 mai dyma'r isomer yn safle 6. Roedd cyfansawdd 11 yn newydd mewn propolis ond fe'i disgrifiwyd eisoes mewn detholiadau organig o Monotes africanus. 70 1 Mae data NMR H a 13C o 8-14 ar gael yn y wybodaeth ategol.

【Am ragor o wybodaeth: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】