Mae Cymhariaeth Rhwng QPCR Ac RNA-seq yn Datgelu Heriau Mesur Mynegiad HLA Rhan 2

Normaleiddio

Defnyddiwyd amcangyfrifon mynegiant mewn trawsgrifiadau fesul miliwn (TPM), sef y normaleiddio safonol a gynhyrchir gan Eog ac sy'n cyfateb i swm cymharol trawsgrifiad a roddwyd mewn sampl. Ar gyfer unrhyw enyn penodol, yr amcangyfrif yn syml yw swm y TPMs ar gyfer ei drawsgrifiadau. Mewn rhai achosion pan fyddwn yn dangos amcangyfrifon trawsnewid arferol safonol, gwnaethom drawsnewid y data RNAseq mewn safle arferol gan ddefnyddio pecyn GenABEL R (Aulchenko et al. 2007), a ddefnyddir fel arfer, er enghraifft, mewn modelau llinol o fapio eQTL (Delaneau et al. 2017).

Mae mapio QTL yn ddull o astudio mecanwaith rheoleiddio mynegiant genynnau trwy gymharu'r cysylltiad rhwng mynegiant genynnau ac amryffurfedd genynnau mewn poblogaeth. Mae'r model llinol yn ddull mapio eQTL a ddefnyddir yn gyffredin, a all ddefnyddio model atchweliad llinol i amcangyfrif y gydberthynas rhwng mynegiant genynnau ac amryffurfedd genynnau.

Mae'r system imiwnedd yn system fiolegol gymhleth sy'n amddiffyn y corff rhag heintiau a chlefydau fel canser. Mae rheoleiddio mynegiant genynnau yn chwarae rhan bwysig yn y system imiwnedd a gall effeithio ar ddatblygiad, gwahaniaethu a swyddogaeth celloedd imiwnedd.

Felly, gellir defnyddio modelau llinol o fapio eQTL i ddadansoddi'r berthynas rhwng mecanweithiau rheoleiddio mynegiant genynnau ac imiwnedd. Er enghraifft, gall astudio'r gydberthynas rhwng genoteip penodol a mynegiant genyn imiwn allweddol mewn poblogaeth ddatgelu dylanwad y genoteip hwn wrth reoleiddio mynegiant genynnau imiwn. Gall ymchwil o'r fath ddarparu goleuedigaeth bwysig ar gyfer trin ac atal clefydau imiwnedd. Mae hyn yn dangos pwysigrwydd imiwnedd, felly mae angen i ni wella ein himiwnedd bob dydd. Mae briwgig hefyd yn cael effeithiau gwrth-firws, gwrth-ganser, ac eraill, a all gryfhau imiwnedd Gallu'r system i wrthsefyll a gwella imiwnedd y corff.

Cliciwch ar fanteision iechyd cistanche

Darllenwch aliniad i'r genom cyfeirio

Ar gyfer dadansoddi cwmpas darllen mewn genynnau HLA a adroddwyd yn Ffig. S7, fe wnaethom alinio darlleniadau i'r genom cyfeirio GRCh38 gyda STAR v2.7.3a (Dobin et al. 2013), gan ddefnyddio anodiadau genynnau Gencode v37. Er mwyn rheoli ar gyfer mapio gogwydd mewn genynnau HLA, gwnaethom brosesu'r ffeiliau BAM ymhellach gyda hlamapper v4.3 (Castelli et al. 2018).

Efelychiad

Data gwirionedd daear

I gynhyrchu data efelychiedig, fe wnaethom redeg Salmon v1.3.0 (Patro et al. 2017) yn gyntaf ar y sampl go iawn #66K00003 i ddysgu lefelau mynegiant trawsgrifiadau Gencode v37. Yna fe wnaethom ddefnyddio'r pecyn Polyester (v1.26.0) i gynhyrchu 50 o samplau synthetig gyda lefelau mynegiant trawsgrifiad unfath, ac eithrio HLA-A, -B, a -C. Roedd y lefelau mynegiant ar gyfer y genynnau hyn yn seiliedig ar 50 o unigolion a ddewiswyd ar hap o'n data go iawn (y mae gennym ddata alel HLA ar gael ar eu cyfer). Ar gyfer pob genyn HLA, fe wnaethom ddewis yr isoformau a oedd yn cyfrif am o leiaf 90 y cant o gyfanswm y mynegiant trawsgrifiad codio protein mewn rhediad Eog ar y set ddata go iawn (a arweiniodd at 1 trawsgrifiad yn unig fesul genyn) a phersonoli'r dilyniannau trawsgrifio yn unol â'r alelau HLA a gludir gan bob unigolyn.

Roedd y weithdrefn hon yn ein galluogi i gynhyrchu 50 o unigolion yn synthetig gyda lefelau mynegiant cefndir union yr un fath, ond gyda mynegiant HLA amrywiol ac amryffurfedd HLA wedi'i ymgorffori yn y darlleniadau efelychiedig.

I adlewyrchu ein data go iawn, efelychwyd tri deg miliwn o ddarlleniadau pen pâr 126 bp gyda maint darn cymedrig o 261 bp ar gyfer pob unigolyn, gan ddefnyddio'r rhagosodiadau ar gyfer paramedrau polyester eraill (ee, gwyriad safonol hyd y darn=25 bp, cyfradd gwall=0.005, dosbarthiad unffurf darlleniadau, a dim tuedd). Allbynnau polyester ffeiliau FASTA, y cynhyrchwyd ffeiliau FASTQ ohonynt gyda sgôr ansawdd cyson (symbol cyfatebol "F").

Metrigau ar gyfer cywirdeb

Cafodd TPMs eu cyfrifo ar gyfrifau efelychiedig o ystyried hyd y trawsgrifiad a maint cyfartalog darnau o 261 bp. Defnyddir y gymhareb "TPM Amcangyfrifedig/TPM Gwir" i asesu perfformiad wrth adennill lefelau mynegiant efelychiedig ac mae'n ein galluogi i arsylwi i lawr neu oramcangyfrif.

Graffeg

Fe wnaethon ni baratoi'r holl leiniau yn yr erthygl hon gan ddefnyddio'r pecyn ggplot2 v3.3.2 (Wickham 2016) yn R.

Canlyniadau

Cywirdeb meintioli HLA RNA-seq

O ystyried absenoldeb dull y gellir ei ystyried yn safon aur arbrofol ar gyfer meintioli mynegiant HLA o ddata RNA-seq, i ddechrau fe wnaethom asesu cywirdeb dulliau meintioli RNA-seq ar gyfer HLA gan ddefnyddio data efelychiedig lle mae gwir lefelau mynegiant yn hysbys ers iddynt gael eu cynhyrchu. mewn cyfrifiadur i efelychu arbrofion go iawn. Gwnaethpwyd hyn i ddewis y dull cyfrifiannol gorau ymhlith dulliau seiliedig ar RNA-seq, gan ganiatáu cyferbyniad dilynol â dulliau nad ydynt yn RNA-seq.

Fe wnaethon ni efelychu arbrawf RNA-seq ar gyfer 50 o unigolion gan ddefnyddio'r pecyn Polyester (Frazee et al. 2015). Mae gan yr unigolion synthetig hyn yr un lefelau mynegiant ar gyfer pob genyn yn y genom, ac eithrio HLA-A, -B, a -C, y gwnaethom amrywio'r lefelau mynegiant ar eu cyfer. Gwnaethom hefyd bersonoli’r dilyniannau trawsgrifiadau HLA anodedig o Gencode v37 i gyflwyno amrywiad genetig gwirioneddol a welwyd mewn unigolion a ddewiswyd ar hap o set ddata o 96 o unigolion (a gafodd eu genoteipio gan HLA gan ddilyniannu Sanger fel y disgrifir isod). Roedd gan y trawsgrifiadau personol a ddeilliodd o hyn hunaniaeth dilyniant canolrifol gyda chyfeirnod yn fwy na 95 y cant ar gyfer yr holl loci HLA.

Fe wnaethom gymharu amcangyfrifon o fynegiant HLA a gafwyd trwy ddau ddull biowybodus: (1) "Cyf transcriptome," sy'n defnyddio Eog (Patro et al. 2017) i alinio darlleniadau i'r trawsgrifiad cyfeirio safonol, gan fesur helaethrwydd trawsgrifiadau a (2) "Personol," sydd hefyd yn defnyddio Eog, ond mae mapiau yn darllen i drawsgrifiadau HLA personol, gan adlewyrchu genoteip HLA yr unigolyn (Ffig. 1). Mae'r dull "Personol" yn ymestyn ein strategaeth flaenorol (Aguiar et al. 2019) trwy ddefnyddio trawsgrifiad personol, yn hytrach nag un dilyniant codio canonaidd ar gyfer pob alel a gludir gan yr unigolyn.

Roedd y dull "Cyf transcriptome" yn tanamcangyfrif lefelau mynegiant, yn enwedig ar gyfer alelau gyda chyfran uwch o wahaniaethau dilyniant yn ymwneud â'r genom cyfeirio (Ffig. 1). Disgwylir hyn gan fod cyfradd uwch o anghydweddu rhwng darlleniadau a'r cyfeiriad yn cael effaith negyddol ar aliniad (Brandt et al. 2015). Roedd y dull hwn hefyd yn goramcangyfrif mynegiant HLA-C ar gyfer rhai unigolion, o ganlyniad i ddarlleniadau o HLA-B yn cael eu mapio i'r trawsgrifiadau cyfeirio HLA-C (Ffig. S1). Mae'r dull "Personol", ar y llaw arall, yn rheoli'r gogwydd mapio ac yn cyflawni'r cywirdeb gorau posibl.

Er bod ein hefelychu yn rhoi canlyniadau calonogol o ran meintioli mynegiant HLA gan ddefnyddio RNAseq, rhaid inni ystyried rhai cafeatau. Fe wnaethom addasu dilyniant yr isoformau anodedig yn ôl alelau HLA yr unigolion gan ddefnyddio un set o isoformau ar gyfer pob alel mewn genyn HLA penodol. Defnyddiwyd y dilyniannau hynny wrth efelychu darlleniadau yn ogystal ag wrth feintioli mynegiant; felly, rydym yn disgwyl y cywirdeb gorau posibl. Mewn senario go iawn, gallai alelau HLA gwahanol fod yn gysylltiedig â gwahanol isoformau. Yn ddiweddarach yn y papur hwn, rydym yn trafod enghraifft benodol a welsom ar gyfer HLA-A, sy'n gyson â'r ddamcaniaeth bod rhai isoformau yn gyfyngedig i alelau penodol. Serch hynny, o ystyried ein bod yn ymddiddori’n bennaf yn yr amcangyfrifon mynegiant lefel genynnau a lefel alel HLA, rydym yn disgwyl bod dilyniannau wedi’u personoli yn cynrychioli gwelliant o gymharu ag un trawsgrifiad cyfeirio drwy leihau gogwydd mapio.

Amcangyfrif mynegiant HLA o ddata RNA-seq go iawn

Fe wnaethom berfformio amcangyfrif mynegiant ar ddata trawsgrifiad cyfan RNA-seq ar gyfer 96 o unigolion, ac amcangyfrifwyd lefelau mynegiant arwyneb qPCR ar gyfer HLAA, -B, a -C, a HLA-C yn flaenorol ar eu cyfer (Kulkarni et al. 2013; Ramsuran et al. 2015, 2017), a gellid ei ddefnyddio i gymharu â chanlyniadau RNAseq (gweler Ffig. S2 ar gyfer dadansoddiadau QC ar ddata RNA-seq).

O ystyried cywirdeb uwch y dull personol yn yr efelychiad, rydym yn cyferbynnu'r dull hwn o amcangyfrifon mynegiant RNA-seq i ddulliau eraill nad ydynt yn RNA-seq, ond yn darparu'r canlyniadau ar gyfer y dulliau cyfeirio sy'n seiliedig ar drawsgrifiad yn y "Gwybodaeth Atodol. " Fe wnaethom bersonoli'r dilyniannau trawsgrifio o ystyried y genoteipiau HLA unigol a gafwyd trwy ddilyniannu Sanger. Fe wnaethom redeg HLApers (Aguiar et al. 2019) a Kourami (Lee a Kingsford 2018) i gasglu alelau yn uniongyrchol o'r data RNA-seq a chadarnhau galwadau Sanger (gweler "Deunyddiau a dulliau").

Mae'r amcangyfrifon mynegiant lefel genynnau yn dangos mai HLA-B sydd â'r mynegiant uchaf ymhlith loci HLA yn ein set ddata, ac yna HLA-C a HLA-A (Ffig. 2A). Mae'r gorchymyn hwn yn gyson â set ddata gwaed cyfan GTEx (GTEx Consortium 2020) a chyda dull RNAseq cipio HLA blaenorol a gymhwyswyd i PBMCs (Yamamoto et al. 2020). Fodd bynnag, mae’r patrwm hwn yn wahanol i’r hyn a welwyd gan Boegel et al (2018), a arsylwodd lefelau tebyg ar draws genynnau gan ddefnyddio strategaeth wahanol ar gyfer ymdrin â mapio darlleniadau i loci lluosog, a all gyfrannu at y diffyg gwahaniaeth ar draws loci o ran lefel mynegiant ). Bydd yn rhaid i astudiaethau yn y dyfodol dynnu sylw at gyfraniad gwahaniaethau mewn methodolegau neu gyfansoddiad math o gelloedd at y gwahaniaethau hyn.

Cymharu RNA-seq a qPCR ar ddata go iawn

Rydym yn cymharu nesaf RNA-seq mynegiant amcangyfrifon i'r rhai a gafwyd gyda qPCR ( Ffig. 2 B ). Er bod y gydberthynas rhwng mynegiant RNA-seq a qPCR yn ystadegol arwyddocaol ar gyfer pob genyn (p=0.{5}}24, 0.002, 0.000000016, ar gyfer HLA-A, -B, a -C, yn y drefn honno; prawf Spearman ar gyfer cysylltiad cadarnhaol), roedd maint y cydberthynas yn gymedrol ar gyfer HLA-A a -B, ac yn uwch ar gyfer -C. Cynyddodd y defnydd o gyfeirnod personol ar gyfer RNA-seq yn gymedrol y gydberthynas â qPCR o'i gymharu â chyfeirnod safonol (Ffig. S3). Mae hyn yn cytuno â’n harsylwad blaenorol nad yw amcangyfrifon mynegiant lefel genynnau yn sylweddol wahanol rhwng dulliau seiliedig ar genom-gyfeiriadol neu ddulliau wedi’u personoli ar gyfer genynnau HLA dosbarth I (Aguiar et al. 2019), a phrif fantais dulliau personoledig yw’r amcangyfrifon yn y Lefel alel HLA, yr ydym yn ei archwilio isod. Mae'r defnydd o gywiro tuedd mewn Eog (tuedd GC, gogwydd dilyniant-benodol, a thuedd safle-benodol) yn gwella'r gydberthynas â qPCR, gyda'r effaith fwyaf ar gyfer HLA-B (cymharer Ffigurau 2B ac S4, ar gyfer data wedi'i gywiro a heb ei gywiro, yn y drefn honno).

Cymharu lefelau mRNA â mynegiant arwyneb

Gan fod mynegiant RNA yn llawn gwybodaeth am gamau cychwynnol signalau celloedd ac ymateb i ysgogiadau, gall dadansoddi ei berthynas â ffenoteipiau moleciwlaidd i lawr yr afon (fel mynegiant protein ar wyneb y gell) ein helpu i ddeall rôl rheoleiddio ôl-drawsgripiol ac ôl-gyfieithiadol ar mynegiant HLA. Disgwylir gwahaniaethau rhwng RNA a helaethrwydd protein gan eu bod yn ddarostyngedig i ddulliau rheoleiddio gwahanol. Gall effeithiau technegol hefyd gyflwyno gwahaniaethau gan fod technegau RNA a phrotein yn wahanol ac yn cael eu heffeithio gan fathau o wallau nad ydynt yn cydberthyn (Li a Biggin 2015; Kaur et al. 2017; Carey et al. 2019). At hynny, yn achos ein hastudiaeth, mesurwyd mynegiant genynnau ar gyfanswm PBMCs, tra bod mynegiant protein yn cael ei fesur ar gelloedd CD3 a mwy wedi'u didoli. Gyda'r gwahaniaeth hwn mewn golwg, fe wnaethom fesur i ba raddau y gellir rhagweld protein HLA ar wyneb y gell trwy fynegiant mRNA. Perfformiwyd y dadansoddiad hwn ar gyfer HLA-C yn unig gan mai dyma'r unig locws y mae gwrthgorff sy'n gallu clymu pob alel â chysylltiadau cyfartal ar gael ar ei gyfer. Yn ddiddorol, roedd cydberthynas uchel rhwng mRNA a mynegiant protein ar gyfer HLAC, gyda chydberthynas ychydig yn uwch ar gyfer RNA-seq (Ffig. 2 C).

Mynegiant lefel alel HLA

Mae genynnau HLA yn cynnwys elfennau rheoleiddiol sy'n gysylltiedig â thrawsgrifio cyfansoddol a thrawsgrifio wedi'i actifadu'n ddeinamig (René et al. 2016). O ganlyniad, mae mynegiant HLA yn amrywio ar draws meinweoedd a gellir ei fodiwleiddio gan rwydweithiau rheoleiddio a ysgogir gan wahanol ysgogiadau (Anderson 2018; Carey et al. 2019). Mae diddordeb cynyddol mewn deall a yw alelau HLA gwahanol yn gysylltiedig â gwahanol lefelau mynegiant gwaelodol a rhaglenni rheoleiddio (Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020), ac a yw’r amrywiad hwn yn cyfrannu at ffenoteipiau clefyd neu ganlyniadau trawsblannu (Petersdorf et al. 2014, 2015; René et al. 2016; Bettens et al. 2022; Johansson et al. 2022). Felly, cymharwyd amcangyfrifon mynegiant lefel alel HLA ar gyfer qPCR a RNA-seq. Gan fod alelau unigol yn aml yn eithaf prin yn y set ddata, fe wnaethom eu grwpio yn ôl llinachau alelig (hy, grwpiau o alelau a ddiffinnir yn ffylogenetig gan berthynas exons) (Elsner et al. 2002).

Fe wnaethom restru llinachau yn ôl eu lefelau mynegiant yn seiliedig ar ddata RNA-seq a qPCR ac aseswyd cydgordiad safleoedd ar draws dulliau (Ffig. 3). Mae ein dull RNA-seq personol yn darparu amcangyfrifon lefel alel yn uniongyrchol, gan fod dilyniannau alel HLA yn cael eu defnyddio i fynegeio'r aliniadau, felly fe wnaethom archebu llinachau alelig yn ôl eu lefelau mynegiant canolrif. Oherwydd bod ein hamcangyfrifon mynegiant qPCR ar y lefel genynnau ac nad ydynt yn darparu amcangyfrifon lefel alel yn uniongyrchol, fe wnaethom archebu llinachau alelig yn ôl eu heffeithiau mewn model llinol o lefelau mynegiant a eglurir gan genoteip HLA (gweler Ramsuran et al. 2015). Yn Ffig. 3, mae'r gwerthoedd mynegiant yn cael eu plotio ddwywaith ar gyfer pob lefel ar gyfer pob alel yr unigolyn, ac ar gyfer qPCR, yn syml, y mynegiad lefel genyn sy'n cael ei blotio ddwywaith, gan adlewyrchu presenoldeb dau alel.

Mae amcangyfrifon trefn mynegiant yn debycach rhwng RNA-seq a qPCR ar gyfer HLA-C nag ydyw ar gyfer -A a -B (gwahaniaeth trefn absoliwt cyfartalog, lle mae gwahaniaeth trefn yn cyfeirio at y gwahaniaeth a arsylwyd mewn safleoedd o fewn trefn restrol o werthoedd mynegiant , rhwng meintioliad RNA-seq a qPCR, o 2.3 ar gyfer HLA-C, 3.1 ar gyfer -A, a 3.9 ar gyfer -B), gan ddilyn patrwm tebyg o gytundeb i fynegiant lefel genyn, y cawsom y cydberthynas uchaf ar ei gyfer rhwng RNA-seq a qPCR ar gyfer HLA-C.

Ymhlith y llinachau sydd â'r gwahaniaeth mwyaf rhwng RNA-seq a qPCR mae A*11. Fe wnaethon ni fesur mynegiant arwyneb ar is-set o heterosygotau ar gyfer A * 03 neu A * 11 gan ddefnyddio gwrthgorff sydd â'r un cysylltiad â'r ddwy linach a gwelsom fod qPCR yn cydberthyn yn fwy cadarn â mynegiant arwyneb celloedd y ddau alotip hyn nag sydd gan RNA-seq (Ffig. S5). Nesaf, rydym yn cyflwyno gwerthusiad mwy helaeth o orchmynion alel trwy gymharu ag astudiaethau blaenorol o fynegiant mRNA HLA.

Er bod diddordeb mewn cymharu gwahaniaethau mynegiant ymhlith alelau HLA, mae astudiaethau amrywiol yn dangos bod amrywiad mewn mynegiant o fewn llinach alel neu alelig yn aml yn eithaf uchel, a bod gwahaniaethau rhwng alelau o rengoedd gwahanol yn aml yn fach ac yn anarwyddocaol. O ganlyniad, gall fod yn afrealistig disgwyl cynnal rhengoedd ar draws alelau lluosog, ac efallai y byddai’n well cymharu amcangyfrifon mynegiant ar gyfer alelau ar eithafion mynegiant.

Ar gyfer ein data RNA-seq, rydym yn cymharu ein hamcangyfrifon â'r rhai o ddau ddull RNA-seq blaenorol wedi'u teilwra ar gyfer HLA ar PBMCs. Mae cydgordiad da yn gyffredinol â Yamamoto et al. (2020), lle mae A*24, A*02, C*04, a C*06 wedi'u mynegi'n fawr, ac A*03, C*03, a B*15 wedi'u mynegi ar lefelau isel, er ein bod hefyd yn gweld gwahaniaethau o'r fath. fel ar gyfer B*35, a fyddai'n cytuno mwy â'n data qPCR. Pan fyddwn yn cymharu ein data RNA-seq â Johansson et al. (2021), fodd bynnag, gwelwn lawer mwy o wahaniaethau, er bod ganddynt samplau bach iawn ar gyfer llawer o linachau.

Rydym hefyd yn cyferbynnu ein canlyniadau â chanlyniadau dwy astudiaeth qPCR flaenorol a ddefnyddiodd breimwyr alel-benodol. Mae Bettens et al. (2014) defnyddio preimwyr alel-benodol ar gyfer rhai llinachau HLAC a gwelodd C*04 a C*06 fel rhai a fynegwyd yn uchel, tra mynegwyd C*07 a C*03 ar lefelau isel, yn unol â'r hyn sydd gennym ar gyfer RNA-seq. a qPCR. Roedd René et al. (2015) cymhwyso paent preimio alel-benodol ar gyfer HLA-A, ac arsylwi A*02 (uchel) ac A*29 (isel) ar eithafion mynegiant, sy'n cytuno'n fwy â'n canlyniadau RNAseq na'n qPCR; fodd bynnag, gwelwn lawer o wahaniaethau mewn llinachau alelig eraill

Mewn rhai achosion, gallwn hefyd werthuso cytundeb ag astudiaethau swyddogaethol. Er enghraifft, mae dadansoddiadau blaenorol o safleoedd rhwymo ffactor trawsgrifio (TFBS) a gweithgarwch hyrwyddwyr (a adolygwyd yn Anderson 2018), ac astudiaethau ar reoleiddio miRNA (Kulkarni et al. 2011), yn dangos bod C*03 a C*07 yn alelau wedi'u mynegi'n wan, sy'n cytuno â'n harsylwadau ar gyfer RNA-seq a qPCR.

Ffynonellau posibl ar gyfer gwahaniaethau

Gwnaethom ymchwilio nesaf a allai prosesu'r samplau a ddefnyddiwyd ar gyfer RNA-seq fod wedi cyfrannu at y gwahaniaethau rhwng amcangyfrifon mynegiant a gafwyd gyda qPCR ac RNA-seq.

Un pryder penodol oedd hyd yr amser y cafodd y samplau eu storio mewn rhewgell -80 gradd (tua 4 blynedd rhwng y profion qPCR ac RNA-seq), yn ogystal â chamau eraill sy'n benodol i'r arbrawf RNA-seq, gan gynnwys dadmer samplau. Er mwyn mynd i’r afael â hyn, gwnaethom gynnal ail arbrawf RNAseq ar waed ffres wedi’i ail-lunio o 11 o unigolion, sy’n is-set o’r 96 a ddadansoddwyd yn yr astudiaeth hon, a gwnaethom gymharu’r amcangyfrifon mynegiant rhwng y pwyntiau dau-amser. Er bod yr ail asesiad hwn yn cynnwys gwahaniaethau technegol a biolegol yn ymwneud â'r arbrawf RNA-seq cyntaf ( Ffig. S6 A a B ), mae'r cydberthynas trawsgrifiad-eang mewn amcangyfrifon mynegiant rhwng pwyntiau amser yn uchel ( Ffig. S6 C ).

Er y gall asesu cydberthynas ag 11 o unigolion fod yn swnllyd, mae cydberthynas mewn genynnau HLA ymhlith y cydberthyniadau mwyaf o ran genynnau rhwng y ddau sampl (Ffig. S6D ac F). Fe wnaethom hefyd gyfrifo cymarebau alel o fewn-unigol, sef y gymhareb mynegiant rhwng y ddau alel HLA unigolyn heterosygaidd, a'u cymharu rhwng pwyntiau amser. Roedd y gydberthynas yn fwy na 0.94 ar gyfer HLA-A, -B, a -C (Ffig. S6E). Felly, ni welsom unrhyw dystiolaeth o gyfraniad mawr o ddiraddiad RNA i egluro'r cydberthynas isel rhwng RNA-seq a qPCR yn ein sampl wreiddiol.

Cyfraniad posibl arall at wahaniaethau rhwng RNA-seq a qPCR yw y gallai alel HLA penodol fod yn fwy tueddol mewn un dull neu'r llall, ac os felly byddai unigolion sy'n cario alelau o'r fath yn cyfrannu at wahaniaethau mawr. Er enghraifft, ar gyfer unigolion sy'n cario A*03, neu ar gyfer homosygotau ar gyfer C*07, mae perthynas negyddol rhwng qPCR a RNA-seq (Ffig. 4A).

Gallai ffynhonnell ychwanegol o wahaniaethau rhwng y dulliau godi o’r ffaith ein bod, yn ein dull RNA-seq, yn personoli holl drawsgrifiadau anodedig Gencode ar gyfer pob alel HLA; fodd bynnag, nid yw gwir amrywiaeth trawsgrifiadau a'i gysylltiad ag alelau HLA penodol yn cael eu deall yn dda. Er enghraifft, mae Kulkarni et al. (2017) yn dangos bod A*01 ac A*11 yn cynhyrchu 3′-UTRs byrrach. Er mwyn ymchwilio i weld a allwn ailadrodd y cyllid hwnnw yn ein data RNA-seq, fe wnaethom fapio’r darlleniadau i’r genom cyfeirio a’u cywiro ar gyfer mapio gogwydd ar enynnau HLA gyda mapiwr hla (Castelli et al. 2018). Yn wir, ar gyfer unigolion sy'n cario A*01 neu A*11, mae'r sylw a ddarllenwyd yn y 3′-UTR o HLA-A yn dangos gostyngiad sydyn ar ~120 bp cyn diwedd y genyn anodedig (Ffig. S7).

Oherwydd bod gwerthoedd trawsgrifiad fesul miliwn (TPM) yn cael eu cyfrifo gan ystyried hyd y cyfeirnod, mae defnyddio cyfeirnod sy'n hirach na'r gwir drawsgrifiad yn arwain at danamcangyfrif mynegiant. Fe wnaethom geisio rheoli'r posibilrwydd o drawsgrifiadau byrrach o'r fath trwy gynnwys fersiwn o bob trawsgrifiad HLA-A gyda 3′-UTR byrrach yn ein mynegai ar gyfer aliniad darllen. Fodd bynnag, ni chanfuwyd unrhyw dystiolaeth o fynegiant o'r isoform byrrach (Ffig. S8), o bosibl oherwydd bod y isoformau byrrach hyn wedi'u cynnwys o fewn y isoformau hyd arferol, ac mae gweithrediad Eog yn pennu pob darlleniad i'r isoform mwy. Yn ddiddorol, mae mynegiant ar y lefel isoform yn datgelu isoform gyda 5′-UTR hirach yn gyfyngedig i A*11, sy'n cyfrannu cyfran fawr o gyfanswm mynegiant yr alel hwn (Ffig. S8).

Fe wnaethom hefyd brofi normaleiddio ein hamcangyfrifon mynegiant, lle gwnaethom addasu'r hydoedd darllen o ystyried y cwmpas darllen sy'n cefnogi terfynfa 3′-UTR procsimol neu ddistal (cyfartaledd pwysol o hyd trawsgrifiadau gan ddefnyddio cwmpas darllen fel pwysau). Er ein bod yn gweld cynnydd o hyd at 20 y cant yn y lefelau mynegiant ar gyfer unigolion sy'n cario A*01 a/neu A*11, dim ond gwelliant bach a welwn yn y gydberthynas â qPCR ar ôl yr addasiad hwn (o rho=0). 20 yn Ffig. 2 i rho=0.24 yn Ffig. 4B).

Mae A*01 ac A*11 ymhlith yr alelau sydd â'r gwahaniaethau rheng mwyaf rhwng RNA-seq a qPCR (Ffig. 3), a gall cynrychiolaeth amherffaith o'u trawsgrifiadau cysylltiedig yn yr anodiad gyflwyno gogwydd yn ein hamcangyfrifon RNA-seq.

Yn olaf, gall dulliau normaleiddio a ddefnyddir i gael amcangyfrifon mynegiant terfynol o'r data qPCR amrwd hefyd fod yn ffynhonnell o wahaniaethau rhwng qPCR ac RNA-gweler amcangyfrifon. Mae profion PCR meintiol ar gyfer genynnau HLA Dosbarth I fel arfer yn chwyddo rhanbarthau o fewn exons 1 i 4, ac mae safoni trwy fynegiant genyn cadw tŷ fel B2M ( 2-microglobwlin) fel arfer yn cael ei wneud (fel oedd yn wir yn yr astudiaeth bresennol ). Y sail resymegol ar gyfer y weithdrefn hon yw, os caiff lefelau mynegiant eu safoni gan gyfeirnod a fynegwyd yn sefydlog, bod yr amcangyfrifon ar gyfer gwahanol unigolion yn cael eu rhoi ar yr un raddfa, gan ganiatáu ar gyfer cymariaethau ar draws unigolion.

Mae B2M yn amgodio'r gadwyn golau yn y moleciwl HLA Dosbarth I, ac mae'n gredadwy bod genynnau B2M a HLA dosbarth I rywfaint o gydlyniad mynegiant, gan eu bod yn rhannu pensaernïaeth hyrwyddwr tebyg (Kobayashi a van den Elsen 2{{1{{{12}) }}} 12; Vijayan et al. 2019), a gellir ei reoleiddio gan ffactorau trawsgrifio a rennir (er enghraifft, mae NLRC5/CITA yn cymell mynegiant HLA dosbarth I a B2M mewn llinellau cell Jurkat (Meissner et 2{{20}}10). Gall normaleiddio mynegiant genynnau HLA drwy werthoedd cydberthynol gyflwyno gogwydd yn ein hamcangyfrifon qPCR, yn enwedig ar gyfer HLA-B, y gwelwn lefel uchel ar ei gyfer cydberthynas â mynegiant B2M (Ffig. 4C) Gall graddio newidyn yn ôl newidyn gwahanol ond cydberthynol gyflwyno aflonyddwch trwy ddod â gwerthoedd eithafol i ganol y dosbarthiad a lleihau amrywiant; yn gyson â'r rhagdybiaeth hon, cyfernodau amrywiad y data qPCR yw 0.61 a 0.50 ar gyfer HLA-A a -C, yn y drefn honno, ond yn disgyn i 0.17 ar gyfer HLA-B (fel cymhariaeth, CVs ar gyfer data RNA-seq yw 0.20, 0.14, a 0.29 ar gyfer HLA-A, -B, a -C , yn y drefn honno). Fodd bynnag, gan ddefnyddio'r un dyluniad qPCR, Ramsuran et al. (2017) mynegiant HLA-B wedi'i normaleiddio gan naill ai genyn B2M, GAPDH, 18 s, a b-Actin, a gwelwyd canlyniadau cyson iawn, nad yw'n cefnogi effaith normaleiddio B2M i'r amcangyfrifon qPCR.

Trafodaeth

Gall amcangyfrifon dibynadwy o fynegiant trawsgrifiad HLA gyfrannu at gwestiynau ymchwil amrywiol, ac er bod canlyniad afiechyd yn cael ei archwilio’n aml yng nghyd-destun amrywiad codio HLA, mae lefelau mynegiant hefyd yn debygol o esbonio amrywiad mewn canlyniadau clinigol (adolygwyd yn Dendrou et al. 2018; ac mewn Johansson et al. 2022). Mae gan lefelau mynegiant y potensial hefyd i lywio penderfyniadau wrth gynllunio trawsblaniad bôn-gelloedd hematopoietig; er enghraifft, os nad oes cyfatebiaeth berffaith ar gael wrth ddethol rhoddwyr allogeneig, mae'n ymddangos yn fuddiol dewis y rhai nad ydynt yn cyfateb i alelau mynegiant isel (Petersdorf et al. 2014, 2015). Gall amcangyfrifon dibynadwy o fynegiant trawsgrifiad hefyd fod o gymorth i nodi eQTLs sy’n sail i reolaeth mynegiant HLA, y gellid eu hintegreiddio i ganfyddiadau GWAS, trwy holi a yw trawiadau hysbys yn rhanbarth MHC yn cyd-daro ag eQTLs ar gyfer genynnau HLA (gweler, e.e., Tabl S6 yn Aguiar et al. 2019). Yn fwy cyffredinol, bydd gwell amcangyfrifon o fynegiant trawsgrifiad HLA yn ein helpu i ddeall pensaernïaeth enetig rheoleiddio HLA, gan nodi cyfraniad cymharol amrywiadau cis-weithredol (hy, y rhai yng nghymdogaeth y genyn HLA y maent yn ei reoleiddio) ac amrywiadau trafodion (y rhai pell lleoliadau genomig, gan gynnwys ar gromosomau eraill). Bydd hyn yn darparu gwybodaeth ynghylch i ba raddau y mae amrywiad mewn mynegiant HLA yn briodwedd alel-benodol yn erbyn nodwedd ryng-unigol sy'n annibynnol ar hunaniaeth alelig (gweler Bettens et al. 2022).

Mae technegau meintiol PCR wedi ein galluogi i ddatgelu cysylltiadau rhwng mynegiant HLA a ffenoteipiau clefyd. Yn fwy diweddar, mae RNA-seq wedi dod yn ddull o ddewis i asesu mynegiant genynnau mewn setiau data trawsgrifiad cyfan mawr o wahanol boblogaethau. Mae gallu echdynnu gwybodaeth gywir ar gyfer mynegiant HLA o ddata o'r fath yn her bwysig, a chynigiwyd llawer o ddulliau i gyflawni'r nod hwn. Fodd bynnag, ni wyddys ar hyn o bryd i ba raddau y mae'r canlyniadau sy'n deillio o ddadansoddiadau RNA-seq yn cyd-fynd â'r rhai a gronnwyd trwy ddefnyddio qPCR. Er bod y dulliau hyn yn targedu'r un ffenoteip moleciwlaidd (digonedd RNA), maent yn wahanol iawn yn y technegau arbrofol a ddefnyddir, y dulliau o ddadansoddi a normaleiddio'r data, y gweithdrefnau biowybodeg, a'r rhagfarnau y maent yn ddarostyngedig iddynt.

Hyd y gwyddom, roedd astudiaethau blaenorol a oedd yn cymharu dulliau RNA-seq wedi'u teilwra ar gyfer HLA â qPCR yn cynnwys samplau bach. Er enghraifft, mae Johansson et al. Dilysodd (2021) eu RNA-seq wedi'i dargedu gan HLA gyda qPCR ar 5 sampl yn unig yn HLA-C, gan ariannu cyfernod cydberthyniad Pearson o 0.9, nad oedd yn arwyddocaol (p=0.08) .

Yn yr astudiaeth bresennol, gwnaethom gymharu amcangyfrifon mynegiant meintiol PCR a RNA-seq ar gyfer y genyn dosbarth I HLA clasurol HLA-A, -B, a -C mewn set gyfatebol o 96 o unigolion. Canfuom gydberthynas gymedrol ond arwyddocaol mewn mynegiant dros sampl o 96 o unigolion. O ystyried y diffyg safon aur ar gyfer cymharu'r amcangyfrifon hyn, gall gwallau amcangyfrif a thueddiadau sy'n gysylltiedig â'r ddau ddull gyfrannu at y canlyniad cyffredinol.

Archwiliwyd effeithiau ffactorau amrywiol a allai esbonio'r gydberthynas isel rhwng amcangyfrifon RNA-seq a qPCR, megis amcangyfrif mynegiant gwael ar gyfer alelau HLA penodol a normaleiddio gan un genyn cadw tŷ yn qPCR. Ni ellir cyffredinoli ein canlyniadau i bob cynllun qPCR neu biblinell RNA-seq, y mae amrywiaeth eang o wahanol ddulliau ar eu cyfer. Fodd bynnag, hyd y gwyddom, dyma'r gymhariaeth uniongyrchol gyntaf rhwng qPCR ac RNA-seq ar gyfer amcangyfrif mynegiant HLA.

Mae ein hastudiaeth yn awgrymu meysydd y mae angen eu gwella wrth benderfynu ar fynegiant trawsgrifiad HLA. Dylai cymariaethau rhwng RNA-seq a qPCR, er enghraifft, ddefnyddio prosesu unffurf o samplau ar draws dulliau (ee, yr un protocol ynysu RNA, amser storio / dadmer, cywirdeb RNA) i gyfyngu ar wahaniaethau artiffisial sy'n gysylltiedig â'r dulliau hyn. Mae mapio darlleniadau byr i genomau cyfeirio sengl neu drawsgrifiadau yn cynhyrchu rhagfarnau, ac mae angen strategaethau sy'n darllen mapiau sy'n rhoi cyfrif am amryffurfedd HLA. O ystyried bod nifer o strategaethau i gyflawni hyn (Boegel et al. 2012; Lee et al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020), bydd yn allweddol i gymharu'r cywirdeb cymharol y dulliau hyn.

Mae hefyd angen datblygu dulliau sy'n rhoi cyfrif digonol am amrywiad isoform, nid yn unig i ddarparu haen arall o wybodaeth ond hefyd amcangyfrifon mynegiant mwy cywir, gan fod normaleiddio cyfrifiadau darllen â hyd trawsgrifiad anghywir yn ffynhonnell bosibl o wallau. Yn y cyd-destun hwn, gall data hir-ddarllen, sy'n cynhyrchu gwybodaeth drawsgrifiad lawn yn uniongyrchol, fod yn arf pwerus (Cornaby et al. 2022). Yn olaf, dylid hefyd ystyried amrywiad rhif copi, nodwedd hysbys ar gyfer rhai loci HLA (ee, DRB), wrth feintioli lefelau mynegiant.

Diolchiadau

Diolchwn i Tatiana Torres (Prifysgol São Paulo), Yang Luo (Ysgol Feddygol Harvard), ac aelodau'r Consortiwm Bioleg ar y Cyd yn Boston, am eu trafodaethau defnyddiol.

Cyfraniad awdur

Cyfrannodd Diogo Meyer, Mary Carrington, Richard M. Single, a Vitor RC Aguiar at genhedlu a dyluniad yr astudiaeth. Perfformiwyd paratoi deunydd, casglu data, ac arbrofion gan Maureen P. Martin, Veron Ramsuran, Smita Kulkarni, Arman Bashirova, Danillo G. Augusto, a Mary Carrington. Perfformiwyd dadansoddiad data gan Vitor RC Aguiar, Erick Castelli, Richard M. Single, Maria Gutierrez-Arcelus, a Diogo Meyer. Ysgrifennwyd y llawysgrif gan Vitor RC Aguiar a Diogo Meyer. Darllenodd yr holl awduron, gwnaethant gyfraniadau, a chymeradwywyd y llawysgrif derfynol.

Ariannu

Darparodd Asiantaeth Ariannu São Paulo (FAPESP, http://www.fapesp. br/en/) gyllid i DM (2012/18010-0 a 2013/22007-7) ac i VRCA (2014/{{{). 5}} a 2016/24734-1). Darparodd y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol, UDA gyllid i DM (NIH R01 GM075091), a gefnogodd ran o'r postdoc VRCA. Darparodd Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) a’r Weinyddiaeth Iechyd, Brasil gyllid ar gyfer arbrofion RNA-seq ac ymweliadau teithio ymchwil, fel rhan o gynnig ar y cyd rhwng yr UD a Brasil a ddyfarnwyd i MC a DM (470043/{{{{13}) }). Mae NIH / NIAID R01AI157850 yn cefnogi SK. Ariannwyd VR gan Gyngor Ymchwil Feddygol De Affrica (SAMRC) gyda chyllid gan yr Adran Gwyddoniaeth a Thechnoleg (DST); a hefyd wedi'i gefnogi'n rhannol drwy'r Rhwydwaith Affrica Is-Sahara ar gyfer Rhagoriaeth Ymchwil TB/HIV (SANTHE), menter DELTAS Affrica (Grant # DEL-15-006) gan yr AAS.

Mae'r prosiect hwn wedi'i ariannu'n gyfan gwbl neu'n rhannol ag arian ffederal gan Labordy Cenedlaethol Frederick ar gyfer Ymchwil Canser, o dan Gontract Rhif HHSN261200800001E. Nid yw cynnwys y cyhoeddiad hwn o reidrwydd yn adlewyrchu barn neu bolisïau'r Adran Iechyd a Gwasanaethau Dynol, ac nid yw sôn am enwau masnach, cynhyrchion masnachol na sefydliadau yn awgrymu cymeradwyaeth gan Lywodraeth yr UD. Cefnogwyd yr Ymchwil hwn yn rhannol gan Raglen Ymchwil Intramwrol NIH, Labordy Cenedlaethol Frederick, Canolfan Ymchwil Canser.

Argaeledd data

Mae'r data RNA-seq a gyflwynir yn y cyhoeddiad cyfredol wedi'u hadneuo ac maent ar gael o'r gronfa ddata dbGaP o dan fynediad dbGaP phs003177.v1.p1.

Cyfeiriadau

1. Aguiar VRC, César J, Delaneau O, et al (2019) Amcangyfrif mynegiant a mapio eQTL ar gyfer genynnau HLA gyda phiblinell wedi'i phersonoli. PLoS Genet 15:e1008091.

2. Alcina A, Abad-Grau MDM, Fedetz M et al (2012) Mae amrywiad risg sglerosis ymledol HLA-DRB1*1501 yn gysylltiedig â mynegiant uchel o enyn DRB1 mewn gwahanol boblogaethau dynol. PLoS Un 7:e29819.

3. Anderson SK (2018) Esblygiad moleciwlaidd elfennau sy'n rheoli mynegiant HLA-C: Addasiad i rôl fel ligand derbynnydd tebyg i imiwnoglobwlin lladd-gell sy'n rheoleiddio swyddogaeth celloedd lladd naturiol. HLA 92:271-278.

4. Apps R, Meng Z, Del Prete GQ et al (2015) Lefelau mynegiant cymharol y proteinau dosbarth-I HLA mewn celloedd normal a heintiedig â HIV. J Immunol 194: 3594-3600.

5. Apps R, Qi Y, Carlson JM, et al (2013) Dylanwad lefel mynegiant HLA-C ar reolaeth HIV. Gwyddoniaeth 340:87-91.

6. Mae Arshad N, Laurent-Rolle M, Ahmed WS et al (2023) SARS-CoV-2 proteinau affeithiwr ORF7a ac ORF3a yn defnyddio mecanweithiau gwahanol i is-reoleiddio mynegiant arwyneb MHC-I. Proc Natl Acad Sci USA 120:e2208525120.

7. Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM (2007) GenABEL: llyfrgell R ar gyfer dadansoddi cysylltiad genom-eang. Biowybodeg 23:1294–1296.

8. Bachtel ND, Umviligihozo G, Pickering S, et al (2018) Mae is-reoleiddio HLA-C gan HIV-1 yn addasu i genoteip HLA lletyol. PLoS Pathog 14:e1007257.

9. Bettens F, Brunet L, Tiercy JM (2014) Amrywioldeb alelig uchel mewn mynegiant mRNA HLA-C: cysylltiad â haploteipiau estynedig HLA. Imiwn genynnau 15:176-181.

10. Bettens F, Ongen H, Rey G et al (2022) Rheoleiddio mynegiant dosbarth I HLA trwy amrywiadau genynnau heb godio. PLoS Genet 18:e1010212

11.Boegel S, Bukur T, Castell JC, Sahin U (2018) Yn Silico Teipio o Alelau HLA Clasurol ac An-glasurol o Standard RNA-Seq Reads. Dulliau Mol Biol 1802:177–191.

For more information:1950477648nn@gmail.com