Anwythiad Cyflym I Imiwnedd Amddiffynnol Yn Erbyn Pla Niwmonic Gan Yersinia Pestis Polymeric F1 Ac Antigenau LcrV

Crynodeb:

Mewn astudiaeth ddiweddar, fe wnaethom ddangos bod brechu ag antigen capsiwl F1 polymerig y pathogen pla Yersinia pestis wedi arwain at sefydlu ymateb imiwn hiwmor amddiffynnol yn gyflym trwy actifadu celloedd B1b cynhenid ​​​​tebyg yn ganolog. I'r gwrthwyneb, methodd y fersiwn monomerig o F1 â diogelu anifeiliaid wedi'u brechu yn brydlon yn y model hwn o'r pla bubonig. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom archwilio gallu F1 i roi cychwyniad cyflym imiwnedd amddiffynnol yn y model llygoden mwy heriol o bla niwmonic. Arweiniodd brechu ag un dos o F1 wedi'i arsugniad ar alwminiwm hydrocsid amddiffyniad effeithiol rhag dod i gysylltiad mewn-treinio angheuol dilynol i straen Y. pestis llawn ffyrnig o fewn wythnos. Yn ddiddorol, roedd ychwanegu'r antigen LcrV wedi lleihau'r amser sydd ei angen ar gyfer cyflawni imiwnedd amddiffynnol mor gyflym i 4-5 diwrnod ar ôl y brechiad. Fel y canfuwyd yn flaenorol, roedd strwythur polymerig F1 yn hanfodol i ddarparu'r ymateb amddiffynnol cyflymach a welwyd trwy frechu â LcrV. Yn olaf, mewn astudiaeth hirhoedledd, arweiniodd brechiad sengl gyda F1 polymerig ymateb humoral uwch a mwy unffurf na brechiad tebyg gyda monomerig F1. Fodd bynnag, yn y lleoliad hwn, ategwyd cyfraniad pennaf LcrV at imiwnedd hirdymor yn erbyn her pwlmonaidd angheuol.

Mae perthynas agos rhwng ymatebion imiwnedd humoral amddiffynnol ac imiwnedd. Mae'r ymateb imiwnedd humoral amddiffynnol yn ymateb amddiffyn y corff yn erbyn pathogenau tramor, sy'n cael ei gymryd rhan yn bennaf gan wrthgyrff. Mae imiwnedd yn cyfeirio at allu'r corff i wrthsefyll goresgyniad pathogenau tramor. Gall yr ymateb imiwnedd humoral amddiffynnol hyrwyddo effaith lladd celloedd imiwnedd, gwella ymwrthedd y corff, a thrwy hynny wella imiwnedd. Yn ogystal, gall yr ymateb imiwnedd humoral amddiffynnol hefyd reoleiddio cydbwysedd y system imiwnedd, rheoli gweithgaredd y system imiwnedd, ac osgoi gor-ymateb ac achosion o glefydau hunanimiwn. Felly, mae ymateb imiwnedd humoral amddiffynnol yn hanfodol i gynnal iechyd y corff a gwella imiwnedd. Yn ogystal, mae imiwnedd dynol hefyd yn bwysig iawn, a all ein hatal rhag cael ein hymosod gan firysau. Gall cistanche wella imiwnedd. Mae Cistanche yn gyfoethog mewn gwahanol sylweddau gwrthocsidiol, megis fitamin C, fitamin C, carotenoidau, ac ati Gall y cynhwysion hyn chwilota radicalau rhydd, Lleihau straen ocsideiddiol a gwella ymwrthedd system imiwnedd.

Cliciwch budd-daliadau cistanche tubulosa

Geiriau allweddol:

brechu; pla niwmonig; amddiffyniad cyflym; polymerig F1; monomerig F1; LcrV; model llygoden.

1. Rhagymadrodd

Mae'r bacteriwm Gram-negyddol Yersinia pestis yn gyfystyr ag asiant etiologic pla bubonig a niwmonic. Mae cannoedd o filiynau wedi ildio oherwydd natur farwol yr heintiau a achoswyd gan y pathogen dinistriol hwn mewn tri phandemig mawr ac mewn nifer o achosion lleol a gofnodwyd yn ystod y ddau fileniwm diwethaf [1,2]. Oherwydd ei heintiad uchel a marwoldeb, mae Y. pestis yn cael ei ddosbarthu fel asiant bioterfysgaeth posibl (https://www.cdc.gov/plague/ bioterrorism/index.html, cyrchwyd ar 9 Gorffennaf 2021). Ers darganfod gwrthfiotigau a'u defnyddio'n helaeth, mae nifer yr achosion a marwolaethau a achosir gan y pla wedi lleihau'n sylweddol [3,4].

Serch hynny, mae gan therapi gwrthfiotig yn erbyn y pla gyfyngiadau; i fod yn effeithiol, rhaid rhoi'r driniaeth yn fuan ar ôl i'r symptomau ddechrau sydd, ar y dechrau, yn debyg i symptomau haint anadlol uchaf cyffredin ac felly'n aml yn cael eu camddiagnosio. Gall unrhyw oedi wrth roi gwrthfiotigau penodol ar gyfer therapi pla amharu ar eu heffeithiolrwydd ac arwain at farwolaethau sylweddol ymhlith unigolion sy'n cael eu trin [5]. Mae ynysu diweddar straenau Y. pestis ffyrnig sy'n gwrthsefyll gwrthfiotigau lluosog, gan gynnwys y rhai a argymhellir ar gyfer therapi, a'r pryder y gallai ffenoteipiau wedi'u newid o'r fath gael eu cyflwyno'n faleisus i straenau ffyrnig ar gyfer rhyfela biolegol neu fioderfysgaeth yn golygu bod angen datblygu gwrthfesurau ychwanegol [6–8] . Yn wir, mae'r defnydd diweddar o wrthfiotigau ail linell, dulliau therapiwtig ychwanegol, a'r cyfuniad o therapi gwrthfiotig a phage yn dangos canlyniadau addawol ym model y llygoden o bla niwmonic [9,10].

Rydym wedi dangos yn ddiweddar gan ddefnyddio model y llygoden o'r pla bubonig bod gweinyddu'r antigen capsiwlaidd F1 o Y. pestis yn ennyn imiwnedd amddiffynnol o fewn dyddiau ac, felly, yn gallu bod yn ymyriad therapiwtig ar gyfer atal y clefyd [11,12]. Roedd y amddiffyniad cyflym hwn yn cynnwys actifadu celloedd B1b tebyg i gynhenid ​​sy'n byw yn y ceudodau peritoneol a phlwrol, gan arwain at gynhyrchu gwrthgyrff IgM ac IgG gwrth-F1 cylchredol [11,12]. Roedd strwythur polymerig F1 yn hanfodol ar gyfer sefydlu imiwnedd gwrth-bla yn gyflym, fel y dangoswyd gan yr arsylwi, yn groes i F1 polymerig, bod protein F1 trynewid crwn monomerig wedi'i beiriannu wedi methu â chysylltu â chelloedd peritoneol B1b yn syth ar ôl imiwneiddio, a yn unol â hynny, gohiriwyd cynhyrchu gwrthgyrff gwrth-F1 [12]. Yn yr astudiaeth hon, gan ddefnyddio model llygoden o haint pestis intranasal Y., fe wnaethom archwilio gallu'r antigen F1 i ddarparu imiwnedd amddiffynnol cyflym yn erbyn pla niwmonig, sy'n cynrychioli amlygiad mwyaf difrifol y clefyd.

Mae'r astudiaeth hon yn sefydlu, fel yn achos imiwnedd pla bubonig, bod natur polymerig F1 yn hanfodol ar gyfer imiwnedd cyflym yn ogystal â pharhaol yn dilyn brechu gydag un dos o'r antigen. Gan fod antigenau F1 a LcrV yn cynrychioli'r ymgeiswyr mwyaf tebygol o frechlynnau is-uned gwrth-bla a dangoswyd eu bod yn ennyn imiwnedd amddiffynnol cyflym mewn model llygoden o'r pla niwmonig [13], fe wnaethom ymestyn yr astudiaeth hon trwy fynd i'r afael â'r posibilrwydd o gyflymu ymhellach yr amddiffyniad rhag pla niwmonig gan F1 cyfun â'r fformiwleiddiad LcrV.

2. Defnyddiau a Dulliau

2.1. Datganiad Moeseg

Cynhaliwyd yr astudiaeth hon yn gwbl unol â'r argymhellion ar gyfer Gofal a Defnyddio Anifeiliaid Labordy y Sefydliad Cenedlaethol dros Iechyd. Perfformiwyd yr holl arbrofion anifeiliaid gan gyfraith Israel a chawsant eu cymeradwyo gan y Pwyllgor Moeseg ar gyfer arbrofion anifeiliaid yn Sefydliad Israel ar gyfer Ymchwil Fiolegol (Rhifau Trwydded: IACUC-IIBR M-50-18, IACUC-IIBR M-36-19, IACUC -IIBR M-64-19, IACUC-IIBR M-73-20). Yn dilyn yr her intranasal, roedd y llygod yn cael eu monitro'n ddyddiol. Defnyddiwyd pwyntiau terfyn trugarog yn ein hastudiaethau goroesi. Cafodd llygod a oedd yn dangos colli'r atgyrch unioni eu lladd gan ddadleoliad ceg y groth.

2.2. Anifeiliaid

Prynwyd llygod benywaidd chwe i wyth wythnos oed C67BL/6 benywaidd oddi wrth Envigo (Jerwsalem, Israel). Prynwyd CDau gwrywaidd a benywaidd o oedran tebyg gan Charles River (DU).

2.3. Imiwneiddio Anifeiliaid ag Antigenau wedi'u Puro

PolyF1: Cafodd y protein F1 polymerig ei buro o uwchnatur diwylliant celloedd E. coli gan fynegi caf1 operon y straen Y. pestis Kimberley53, fel y disgrifiwyd yn flaenorol yn [14]. Penderfynwyd bod pwysau moleciwlaidd F1 wedi'i buro yn uwch na 1000 kDa yn ôl cromatograffaeth eithrio maint gan ddefnyddio colofn Superdex 200 (Cytiva, MA, UDA).

MonoF1: ​​Cafwyd y codio plasmid pAH34L ar gyfer y monomerig F1 (cpCaf1) yn garedig gan Dr Daniel Peters a'r Athro Jeremy H. Lakey, Prifysgol Newcastle, y DU [15]. Cyflwynwyd pAH34L i E. coli Lemo21 (DE3) a brynwyd o New England Biolabs (Ipswich, MA, UDA). Tyfwyd trawsnewidyddion a ddewiswyd ar hap ar 37 ◦C a 220 rpm mewn cawl Gwych wedi'i ategu ag ampicillin (200 µg/mL). Ysgogwyd mynegiant yng nghanol y log trwy ychwanegu isopropyl -thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM), a chafodd y diwylliannau eu deor wedyn yn 18 ◦C a 220 rpm am 19 h ychwanegol. Roedd pelenni bacteriol yn cael eu pwyso (pwysau gwlyb) a'u solubileiddio ag adweithydd lysis cell CelLytic™ B yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (Merck-Sigma, Rehovot, Israel).

Cafodd y protein ymasiad Tol3-cpCaf1 ailgyfunol ei buro gan gromatograffaeth hylif pwysedd wedi'i hwyluso (PFLC) ar golofn HP HisTrap™ yn unol â chanllawiau'r gwneuthurwr (Cytiva, MA, UDA). Gwahanwyd moiety Tol3 oddi wrth cpCaf1 trwy holltiad â thrombin (Merck-Sigma, Rehovot, Israel) ac adamsugniad o'r cyntaf ar golofn HP HisTrap™ wedi'i hadfywio. Casglwyd y moiety cpCaf1 (monoF1) o'r ffracsiwn llif drwodd a'i ddeialu'n helaeth yn erbyn 1 × PBS. Tynnwyd endotocsinau gan ddull gwahanu cam Triton X-114, fel y disgrifiwyd yn flaenorol yn [16]. Mesurwyd maint protein gan ddefnyddio'r dull asid bicinchoninig (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo). Gwiriwyd purdeb y F1 monomerig gan SDS-PAGE ac yna staenio glas Coomassie a thrwy ddadansoddiad blot y Gorllewin gan ddefnyddio gwrthgyrff gwrth-F1 cwningen, fel y disgrifiwyd yn flaenorol yn [11].

LcrV: Cloniwyd y dilyniant codio LcrV hyd llawn o straen ffyrnig Y. pestis Kimberley53 i fector mynegiant pGEX (GE Healthcare, Chicago, IL, UDA) a'i gyflwyno i gelloedd E. coli. Canfuwyd bod y dilyniant codio LcrV yn union yr un fath â LcrV straen Y. pestis CO92. Cynhyrchwyd a phuro LcrV ailgyfunol fel y disgrifiwyd gan Leary et al. [17]. Tynnwyd endotocsinau o LcrV wedi'i buro fel y disgrifir uchod.

Arsugnwyd cyfanswm o 20 i 160 µg o polyF1 a LcrV neu 80 µg o monoF1 ar 2 y cant o gel alwminiwm-hydrocsid (AlOH) (Brennentag Biosector, Denmarc) i grynodiad terfynol o 0.36 y cant . Cafodd llygod unigol eu himiwneiddio'n isgroenol gan ddefnyddio cyfaint cyson o 200 µL a roddwyd i waelod y cefn.

2.4. Nodweddu'r Ymateb Serolegol

Roedd llygod yn gwaedu cynffonau, a phenderfynwyd ar titers IgG unigol a gynhyrchwyd yn erbyn F1 a LcrV yn y serwm gan ELISA, fel yr adroddwyd yn flaenorol yn [11]. Mesurwyd titers IgG1 ac IgG3 gan ddefnyddio gwrthgyrff gwrth-lygoden gafr alcalin ffosffatase-cyfunedig alcalin penodol (Jackson Laboratories, Farmington, CT, UDA).

Ladd broncoalfeolar (BAL): Cafodd llygod eu hanestheteiddio gan hydoddiant o ketamine/xylazine, a datgelwyd y tracea, gan gymryd gofal arbennig i beidio ag achosi unrhyw waedu. Gwnaethpwyd toriad bach, a {{{0}}caniwla medrydd hyblyg (BD Neoflon™) ei fewnosod a'i ddiogelu gan bwytho llawfeddygol. Cafodd yr ysgyfaint eu golchi â 1 × PBS gan ddefnyddio chwistrell 1 mL luer-clo a oedd wedi'i gysylltu â'r canwla diogel. Taflwyd hylif lafa oedd wedi ei halogi ag unrhyw arwydd o waed. Cliriwyd yr hylif lavage gan allgyrchiad (400× g, 4 ◦C), a chafodd yr uwchnatant ei hidlo'n ddi-haint cyn ELISA. Penderfynwyd ar grynodiadau gwrthgyrff gwrth-F1 a gwrth-LcrV yn hylif BAL (BALF) anifeiliaid wedi'u brechu gan ddefnyddio Mab 57 (F1) a Mab 59 (LcrV) gwanedig a adroddwyd yn flaenorol yn [18] fel cromliniau safonol a gynhwyswyd ym mhob {{14} } plât prawf yn dda. Penderfynwyd bod y terfynau canfod (LODs) ar gyfer gwrthgyrff gwrth-F1 IgG a gwrth-LcrV yn y BALF yn 0.8 ng/mL a 0.15 ng/mL, yn y drefn honno.

2.5. Haint Llygoden

Perfformiwyd heintiau intranasal (mewn) fel y disgrifiwyd yn flaenorol yn [19]. Yn gryno, cynaeafwyd dolen yn llawn o gytrefi bacteriol Y. pestis Kim53 nodweddiadol a'i wanhau mewn cawl trwyth y galon (HIB, Difco) wedi'i ategu â 0.2 y cant xylose a 2.5 mM CaCl2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i OD660 o 0.01 ac wedi tyfu am 22 h ar 28 ◦C ac 100 rpm. Ar ddiwedd y cyfnod deori (OD660 ≈ 4), cafodd y diwylliant ei olchi a'i wanhau mewn halwynog (0.9 y cant NaCl) i'r dos heintus a ddymunir a ddilyswyd trwy gyfrif unedau ffurfio cytref ar ôl platio a deori ar blatiau BHIA (48 h yn 28 ◦C). Anestheteiddiwyd llygod â chymysgedd o 0.5 y cant ketamine HCl a 0.1 y cant xylazine ac yna eu heintio yn fewnnasol â 35 µL/llygoden yr ataliad bacteriol. Y intranasal LD50 straen Kim53 tuag at C57BL/6 llygod yw 1100 cfu a 2100 cfu tuag at CD-1 llygod. Cyfrifwyd y gwerthoedd LD50 yn ôl y dull a ddisgrifiwyd gan Reed a Muench [20]. Roedd morbidrwydd a marwolaethau llygod yn cael eu monitro bob dydd am 21 diwrnod. Ar ddiwedd y cyfnod hwn, gwiriwyd clirio'r pathogen trwy blatio homogenadau dueg o anifeiliaid sydd wedi goroesi ar blatiau BHIA wedi'u hategu â 200 µg/ml streptomycin (48 h ar 28 ◦C).

2.6. Nodweddu Model Llygoden y Pla Niwmonig

Anestheteiddiwyd llygod a oedd wedi'u heintio'n fewnnasol ar y pwynt amser a nodwyd ar ôl y datguddiad gan doddiant o ketamine/xylazine, a thynnwyd gwaed heparinedig trwy dyllu'r galon. Yn dilyn hynny, cafodd y nod lymff cyfryngol (mdLN), yr ysgyfaint, a'r ddueg eu tynnu allan a'u stwnsio i ataliad un gell ar rwyll neilon 70 µm (hidlen cell, Falcon, Corning, NY, UDA) mewn 1 × PBS . Pennwyd nifer yr Y. pestis Kim53 yn y gwahanol organau a gwaed trwy blatio ataliadau celloedd wedi'u gwanhau'n gyfresol ar blatiau BHIA wedi'u hategu â streptomycin 200 µg/mL. Ar gyfer dadansoddiad histolegol, anestheteiddiwyd llygod, a chafodd eu tracheas eu tunio fel y nodir uchod. Roedd colofn (0.7 × 30 cm, KONTES, St. Louis, MO, UDA) wedi'i llenwi â hydoddiant fformaldehyd byffer (10 y cant terfynol conc.) wedi'i gysylltu â'r caniwla, a chafodd yr ysgyfaint eu "chwyddo" gan ddisgyrchiant yn unig. Cadwyd ysgyfaint llawn gosodion yn yr un byffer am 14 diwrnod ac yna eu prosesu i ffurfio blociau wedi'u mewnblannu â pharaffin. Cafodd adrannau un i dri micromedr eu staenio â staen eosin / hematocsilin safonol (H&E) a gyda phecyn staenio Masson-Goldner (Merck, Rehovot, Israel) ar gyfer canfod ffibrosis. Yn ogystal, cafodd rhannau o'r ysgyfaint eu staenio ar gyfer Y. pestis gan ddefnyddio gwrthgyrff IgG gwrth-F1 cwningod mewnol (1:10,000) a'r pecyn Histostain®-SP (ZYMED®, Invitrogen, Waltham, MA, UDA). ). Delweddwyd darnau lliw gan ddefnyddio camera ICC3 ynghyd â microsgop Axioscope A1 (Zeiss, yr Almaen).

2.7. Dadansoddiad Ystadegol

Penderfynodd Kruskal-Wallis nad oedd yn baramedrig ar gyfer prawf post hoc Dunn pa mor arwyddocaol oedd rhwng y teitrau a gofnodwyd mewn llygod a oedd yn perthyn i fwy na dau grŵp. Defnyddiwyd y prawf gradd log (Mantel-Cox) i gymharu'r cromliniau goroesi a gafwyd yn y gwahanol grwpiau brechu. Ystyriwyd bod gwahaniaethau yn arwyddocaol os p Llai na neu'n hafal i 0.05. Perfformiwyd cyfrifiadau gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism.

3. Canlyniadau

Mewn astudiaeth flaenorol, gwnaethom ddangos bod brechu llygod â ffurf bolymerig frodorol yr antigen capsiwlaidd F1 o Yersinia pestis wedi arwain at gyflymu amddiffyniad rhag y pla bubonig. Yn unol â hynny, awgrymwyd y gellid ystyried gweinyddiaeth F1 nid yn unig fel mesur proffylactig ond hefyd fel ymyriad therapiwtig mewn achosion brys megis achosion sy'n cynnwys straenau sy'n gwrthsefyll gwrthfiotigau sy'n digwydd yn naturiol neu'n faleisus [12]. Yn yr adroddiad hwn, holwyd ysgogi amddiffyniad cyflym yn achos pla niwmonic gan ddefnyddio'r model murine sefydledig sy'n cynnwys datguddiad llygod i'r pathogen trwy frechu mewn trwynol. Dangoswyd bod y model hwn yn cadw'r pathogenedd sy'n nodweddu amlygiadau anadlol pla niwmonig sylfaenol (Ffigur Atodol S1) [10,19,21-24].

3.1. Imiwnedd Amddiffynnol Cyflym a Fforddir gan F1 a LcrV ym Model Llygoden y Pla Niwmonic

Profwyd gallu'r antigen F1 i sicrhau amddiffyniad cyflym gan arbrofion lle cafodd llygod C57BL/6 eu brechu gan un weinyddiaeth o polyF1 wedi'i amsugno gan AlOH (20, 80, a 160 µg/llygoden), tra bod anifeiliaid rheoli yn cael eu chwistrellu â y cynorthwyol. Gwerthuswyd gallu'r llygod sydd wedi'u brechu i oroesi haint mewn trwynol angheuol â'r straen ffyrnig Y. pestis Kim53 (10LD50=11,000 cfu) dri a saith diwrnod ar ôl y brechiad o gymharu ag anifeiliaid rheoli (Ffigur 1 ). Ar ôl tridiau, dim ond estyniad bach o'r amser hyd at farwolaeth a goroesi (o arwyddocâd ystadegol anfoddhaol) a welwyd (Ffigur 1A). Roedd ymestyn yr amser rhwng brechu a her o ddim ond 4 diwrnod arall (cyfanswm o 7 diwrnod) yn galluogi achub yr holl lygod a gafodd eu brechu gyda’r dosau uchel o polyF1 (80 a 160 µg/llygoden) yn ogystal ag 87 y cant o’r llygod a gafodd eu brechu â’r dos isel o polyF1 (Ffigur 1B).

Roedd gallu’r antigen F1 i ysgogi ymateb imiwn amddiffynnol cyflym yn erbyn y pla niwmonic yn ein hannog i archwilio a fyddai imiwneiddio ag antigen amddiffynnol ychwanegol, LcrV, yn gwella cyflwr imiwnedd yr anifeiliaid ymhellach trwy gyflymu dyfodiad imiwnedd amddiffynnol. Yn wir, pan gynhaliwyd her angheuol pestis Y. 3 diwrnod ar ôl y brechiad cyfunol, roedd gweinyddu'r fformiwleiddiad cymysg LcrV a polyF1 (80 µg neu 160 µg o bob un o'r antigenau) yn gallu achub 30-50 y cant o'r llygod (Ffigur 1C). Yn fwyaf nodedig, roedd ymestyn y cyfnod rhwng brechu a her i saith diwrnod yn rhoi amddiffyniad llawn i bob anifail wedi'i frechu ar bob dos o'r antigens (Ffigur 1D). Ni effeithiwyd ar allu polyF1 ar ei ben ei hun neu ar y cyd â LcrV i waddoli imiwnedd amddiffynnol cyflym yn erbyn y pla niwmonig o fewn wythnos gan gynyddu'r dos her o amlygiad intranasal ddeg gwaith (Ffigur 1E), gan gadarnhau cadernid y cyflwr gwarchodedig.

3.2. Cineteg yr Ymateb Hiwmor yn dilyn Brechu gyda F1 a LcrV

Roedd yr arsylw bod y brechlyn LcrV ac F1 cyfun wedi achosi imiwnedd amddiffynnol cyflym yn awgrymu bod ymateb doniol yn cael ei ennyn yn fuan wedi hynny. Er mwyn mynd i'r afael â'r posibilrwydd hwn ac i bennu cyfraniad yr ymateb doniol yn erbyn pob un o'r antigenau at amddiffyniad rhag Y. pestis, dadansoddwyd cineteg y gwrthgyrff IgG penodol a gynhyrchwyd yn erbyn y ddau antigen unigol 5-9 diwrnod ar ôl brechiad dos sengl. o lygod C57BL/6 gyda ffurfiant cymysg o polyF1 a LcrV (Ffigur 2A). Yn ôl y disgwyl, yn seiliedig ar arsylwadau blaenorol, roedd titers gwrthgyrff gwrth-F1 IgG (GMT=1.35 × 103 ) eisoes i'w canfod yn sera'r holl anifeiliaid a frechwyd ar Ddiwrnod 5 ôl-frechu (Ffigur 2B).

Gwelwyd cynnydd graddol yn y titrau gwrthgyrff gwrth-F1 IgG yn y dyddiau canlynol, gan gyrraedd ~60-plyg lefelau uwch ar ôl-frechu Diwrnod 9 (GMT=8.26 × 104, Ffigur 2B). Gellid canfod gwrthgyrff IgG gwrth-F1 hefyd yn hylif yr ysgyfaint gan ddechrau o Ddiwrnod 7 ar ôl y brechiad, gan gyrraedd crynodiad mor uchel â ~1 µg/mL ar Ddiwrnod 9 (Ffigur 2C). Yn ddiddorol, er bod yr ymateb humoral gwrth-LcrV ar ei hôl hi o'i gymharu â'r hyn a gafwyd gan polyF1 (Diwrnod 7 GMT=613, Ffigur 2D), mesurwyd cynnydd uwch yn lefelau gwrthgyrff gwrth-LcrV IgG yn y dyddiau canlynol, gan arddangos cynnydd cyffredinol o ~160-plyg (GMT=1 × 105, Ffigur 2D). Gellid canfod gwrthgyrff IgG gwrth-LcrV hefyd yn hylif ysgyfaint llygod sydd wedi'u brechu yn dechrau o Ddiwrnod 8, er ar grynodiad is o'i gymharu â'r lefelau gwrth-F1 (Ffigur 2E).

Nid oedd yn ymddangos bod y cynnydd sydyn yn y titers IgG gwrth-LcrV, a welwyd ar Ddiwrnodau 8-9 ar ôl y brechiad, yn cynnwys actifadu celloedd B1b tebyg i gynhenid, fel yr awgrymwyd gan yr arsylwi bod ffracsiwn IgG3 o'r gwrthgyrff hyn yn is na'r canfod o'i gymharu â y ffracsiwn gwrthgorff gwrth-F1 IgG3 ([12] a Ffigur Atodol S2). Felly, mae'r data'n nodi y gallai LcrV hefyd gynhyrchu ymateb digrif cyflym gan ddarparu, ar y cyd â F1, amddiffyniad effeithiol rhag y pla niwmonic mor gynnar ag wythnos ar ôl y brechiad. At hynny, mae'r sylw bod gwrthgyrff IgG gwrth-F1 a gwrth-LcrV a gronnwyd yn ysgyfaint anifeiliaid sydd wedi'u brechu yn awgrymu y gallai'r ymateb lleol yn yr ysgyfaint fod yn bwysig ar gyfer cyflawni imiwnedd pla gwrth-neumonic.

3.3. Pwysigrwydd y Strwythur Polymerig F1 ar gyfer Cychwyniad Cyflym Imiwnedd Amddiffynnol

Rydym wedi cyhoeddi canfyddiadau o'r blaen sy'n cefnogi'n gryf y syniad bod pensaernïaeth polymerig cwaternaidd F1 yn hanfodol ar gyfer ei allu i ysgogi ymateb amddiffynnol cyflym yn erbyn pla bubonig [12]. O ganlyniad, yn yr astudiaeth hon, rhoddwyd sylw i'r mater hwn hefyd yn achos amddiffyniad rhag pla niwmonig. Cafodd llygod eu brechu â F1 monomerig neu bolymerig, yn y ddau achos yn golygu cydweinyddu LcrV (80 µg o bob antigen/llygoden). Dri, pedwar, a phum diwrnod yn ddiweddarach, heriwyd llygod yn fewnnasol gyda dos marwol o Y. pestis Kim53. Roedd y data goroesi a ddangosir yn Ffigur 3 yn dangos bod brechu â chymysgedd o polyF1 a LcrV yn amddiffyn 25 y cant , 62.5 y cant , ac 87.5 y cant o'r llygod, yn y drefn honno (Ffigur 3A), rhag her angheuol.

Mewn cyferbyniad, ildiodd yr holl lygod a gafodd eu brechu â'r cymysgedd monoF1 a LcrV i'r haint ac eithrio'r grŵp a frechwyd 5 diwrnod cyn yr her, a ddangosodd lefel isel o amddiffyniad o 25 y cant (Ffigur 3B). Ni wnaeth brechu â fformiwleiddiadau angymysg yn cynnwys naill ai polyF1, monoF1, neu LcrV (80 µg/llygoden) 4 diwrnod cyn yr her ddiogelu anifeiliaid. Fodd bynnag, arweiniodd brechu â polyF1 at oedi sylweddol mewn marwolaethau o gymharu â'r holl grwpiau arbrofol eraill (p < 0.001; Ffigur 3C). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos yn glir bod ffurf polymerig F1 yn hanfodol ar gyfer cael ymateb amddiffynnol cyflym ar y cyd â LcrV.

3.4. Nodweddu'r Imiwnedd Amddiffynnol Hirdymor a Achosir gan Frechiad Sengl gyda F1 a LcrV

Yn olaf, fe wnaethom archwilio a yw'r imiwnedd amddiffynnol hirdymor clasurol yn erbyn pla niwmonig yn wahanol mewn llygod sydd wedi'u brechu gan monoF1 neu polyF1. Yn unol â hynny, cafodd llygod CD1 eu brechu unwaith gyda monoF1 neu polyF1 yn unig, yn ogystal â thrwy weinyddu fformwleiddiadau a oedd yn cynnwys cyfuniad â LcrV. Mesurwyd lefel y gwrthgyrff penodol yn serwm anifeiliaid sydd wedi'u brechu chwe mis yn ddiweddarach. Mae'r data a ddangosir yn Ffigur 4A yn dangos bod y titers IgG gwrth-F1 yn uwch ym mhob grŵp a gafodd eu brechu â polyF1 nag yn y rhai a frechwyd â monoF1. Mesurwyd titers IgG gwrth-LcrV uchel a chyson ym mhob llygod a gafodd eu brechu â LcrV.

Cyfnod o 6 mis ar ôl imiwneiddio (3 diwrnod ar ôl tynnu gwaed yn ôl er mwyn pennu titer), heriwyd llygod yn fewnnasol gyda dos marwol yn cynnwys 100LD50 o Y. pestis Kim53, a chafodd goroesiad ei fonitro am 21 diwrnod (Ffigur 5). Dim ond yn rhannol yr oedd llygod a gafodd eu brechu â polyF1 fel antigen sengl wedi’u diogelu’n rhannol, tra bod pob llygod a gafodd eu brechu â monoF1 wedi ildio i’r haint, yn debyg i lygod rheoli naïf (Ffigur 5A). Yn nodedig, nid oedd y titers IgG gwrth-F1 a fesurwyd yn sera anifeiliaid wedi'u brechu polyF yn dangos cydberthynas gref â goroesiad yn erbyn her ysgyfeiniol (Ffigur 5B). Roedd ychwanegu LcrV yn galluogi amddiffyniad llawn i'r llygod a gafodd eu brechu â monoF1 yn ogystal ag i'r rhai a gafodd eu brechu â polyF1 (Ffigur 5A), gan nodi bod yr ymateb gwrthLcrV wedi galluogi amlygiad llawn o werth amddiffynnol yr ymateb gwrth-F1. Cafwyd canlyniadau tebyg o ran ymatebion digrif a goroesiad ar her ysgyfeiniol mewn llygod CD-1 gwrywaidd sydd wedi’u brechu (Ffigur Atodol S3), sy’n nodi nad yw’r astudiaeth yn dangos tuedd yn ôl rhyw anifeiliaid (sylwer bod yr arbrofion cychwynnol wedi’u cynnal gydag anifeiliaid benywaidd) .

Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall F1 ynddo'i hun ysgogi amddiffyniad cyflym rhag pla niwmonig, sy'n dibynnu ar ei strwythur polymerig naturiol. Roedd ychwanegu LcrV at polyF1 nid yn unig yn lleihau'r amser sydd ei angen i sicrhau amddiffyniad mor gyflym ond hefyd yn darparu imiwnedd amddiffynnol hirfaith ac effeithiol yn erbyn amlygiad ysgyfeiniol o bla, fel y disgrifiwyd yn flaenorol.

4. Trafodaeth

Priodolir yr arwahanrwydd diweddar o fathau ffyrnig Y. pestis sy'n ymwrthol i nifer o wrthfiotigau gan gynnwys y rhai a argymhellir ar gyfer therapi [8,25,26], i'r chwilio am wrthfesurau ychwanegol yn erbyn y pla niwmonig, megis brechlynnau sy'n achosi imiwnedd cyflym, uchel. iechyd y cyhoedd, a pherthnasedd clinigol. Mae brechlynnau, yn gyffredinol, yn cael eu hystyried yn wrthfesurau ataliol yn erbyn clefydau heintus ac felly'n cael eu dosbarthu i bobl iach flynyddoedd ymlaen llaw. Yn unol â hynny, roedd mwyafrif yr astudiaethau rhag-glinigol a archwiliodd ddatblygiad brechlyn yn erbyn y pla yn cynnwys cyfundrefnau brechu hir cyn her angheuol [13,27-29]. Rydym wedi adrodd o'r blaen bod brechu â ffurf polymerig naturiol yr antigen F1 capsiwlaidd yn sbarduno ymateb imiwn cyflym a grymus iawn sy'n ddibynnol ar gelloedd B sy'n amddiffyn yr anifeiliaid hyd yn oed sawl awr ar ôl her angheuol Y. pestis isgroenol [11,12].

Yn yr astudiaethau hyn, rydym wedi dangos bod un brechiad gyda F1 yn achosi cronni gwrthgyrff gwrth-F1 (IgM ac IgG) yn y serwm o fewn sawl diwrnod trwy actifadu celloedd B1b tebyg i gynhenid. Mae'r isboblogi hwn o gelloedd B yn byw yng ngheudod peritoneol llygod ac fel arfer mae'n cynhyrchu ymatebion serolegol yn erbyn antigenau polymerig nonproteinaceous, megis LPS a polysacaridau sy'n cyfansoddi capsiwl llawer o bathogenau (niwmococci, meningococci, ac ati) [30]. Nodweddir yr ymatebion imiwn cyflym hyn gan annibyniaeth celloedd T a chynhyrchu seroteip gwrthgyrff murine IgG3. Fe wnaethom ddangos bod yr holl nodweddion uchod hefyd yn berthnasol i'r ymateb amddiffynnol cyflym a gynhyrchir gan F1. Ar ben hynny, fe wnaethom ddangos bod natur bolymerig F1 yn hanfodol ar gyfer yr ymateb imiwn cyflym hwn, oherwydd methodd y monomerig F1 (a gynhyrchir gan newid cylchol y genyn caf1) ag actifadu celloedd B1b, ar ei hôl hi ar ôl y F1 polymerig mewn cineteg titer IgG, peidio â chynhyrchu seroteip IgG3, a methu â darparu amddiffyniad cyflym. I gyd-fynd â'r ymateb cyflym hwn mae'r ymateb addasol confensiynol arafach sy'n dibynnu ar gelloedd T yn erbyn F1. Felly, rydym yn damcaniaethu bod F1 polymerig yn cynhyrchu dau ymateb serolegol yn gweithredu'n gyfochrog: un sy'n annibynnol ar gelloedd T trwy gelloedd B1b a'r ail un sy'n cynnwys celloedd B ffoliglaidd mewn modd sy'n ddibynnol ar gelloedd T [12].

Yn yr adroddiad hwn, estynnwyd yr astudiaeth flaenorol trwy fynd i'r afael â gallu'r antigen F1 i roi ymateb amddiffynnol cyflym yn y model llygoden mwy heriol o bla niwmonic. Rydyn ni'n dangos y gall un weinyddiaeth o F1 polymerig wedi'i amsugno gan AlOH, saith diwrnod cyn her fewnrwydol angheuol gyda straen pestis Y. ffyrnig, ysgogi ymateb amddiffynnol effeithiol (Ffigur 1). Nid oes gan yr arsylwad rhyfeddol hwn bron unrhyw gynsail, nid yn unig o ran cyflymder yr adwaith ond hefyd o ran y ffaith mai anaml y rhoddwyd sylw i allu'r antigen F1 i roi amddiffyniad mewn model llygoden o'r pla niwmonic [31]. Mae'r sylw a adroddir yma yn unol â'r hyn a ddogfennwyd gan Derbise a'i chydweithwyr [32] ynghylch canfod gwrthgyrff gwrth-F1 yn fuan ar ôl y brechiad. Yma, rydym yn dangos bod ychwanegu LcrV i polyF1 nid yn unig yn fanteisiol yn y tymor hir, fel yr adroddwyd yn flaenorol [33,34], ond hefyd yn cyflymu'r ymateb imiwn amddiffynnol yn erbyn her intranasal Y. pestis i ychydig ddyddiau yn unig (Ffigurau 2 a 5).

Mae'r gallu i gynhyrchu amddiffyniad cyflym yn erbyn pla niwmonig trwy frechu â F1 a LcrV yn cryfhau canfyddiadau tebyg a adroddwyd yn flaenorol gan Williamson a chydweithwyr [13], lle roedd brechu gyda F1 a LcrV yn darparu amddiffyniad cyflym yn erbyn her aerosol gyda Y. pestis. Mae'r cynnydd sydyn yn y titers IgG gwrth-LcrV a welwyd ar Ddiwrnodau 8 a 9 yn dangos bod LcrV yn gweithredu mecanweithiau imiwnedd cryf iawn yn gynnar ar ôl imiwneiddio. Mae diffyg gwrthgyrff gwrth-LcrV IgG3 yn y serwm, eu cineteg gwahanol, a'r lefelau is o wrthgyrff IgG gwrth-LcrV a geir yn hylif yr ysgyfaint yn awgrymu'n gryf bod mecanweithiau imiwnedd arwahanol yn cael eu gweithredu gan yr antigenau F1 a LcrV, y ddau ohonynt yn fwyaf cyffredin. yn debygol o gyfrannu at ysgogi'r ymateb amddiffynnol yn gyflym (Ffigur 3C).

Yn debyg i'n harsylwadau blaenorol yn y model llygoden pla bubonig, roedd y gallu i ysgogi ymateb imiwn amddiffynnol cyflym yn erbyn y pla niwmonic yn dibynnu ar strwythur polymerig yr antigen F1 (Ffigur 3). Mae'r arsylwad hwn yn awgrymu na ddisgwylir i'r brechlyn is-uned gwrth-bla yr ymgeisydd cyffredin, sy'n cynnwys monomerig F1 a LcrV fel protein ymasiad [35,36], ddarparu imiwnedd cyflym yn erbyn y pla niwmonic; fodd bynnag, mae angen archwilio'r rhagdybiaeth hon yn arbrofol. Roedd yr ymateb serolegol a gynhyrchwyd gan LcrV, er ei fod yn arafach nag un polyF1 (Ffigur 2), yn dal i ganiatáu'r ymateb amddiffynnol amddiffynnol cyflym a oedd yn atal effaith angheuol pla niwmonig. Mae'n debyg bod yr ymateb serolegol cymharol gyflym hwn yn deillio o allu'r antigen LcrV i ffurfio dimers neu tetramerau yn yr hydoddiant, fel y darganfuwyd mewn astudiaethau blaenorol [37,38] a'n data heb ei gyhoeddi. Yng ngoleuni ein canfyddiadau ar effaith strwythur amlmerig F1 wrth gyflymu'r broses o gynhyrchu ymateb imiwn digrif, gallai peirianneg ailgyfunol o'r protein LcrV sy'n galluogi aml-mereiddio i raddau helaethach gyflymu'r ymateb ymhellach. Yn unol â'r rhagdybiaeth hon, mae'n werth nodi'r adroddiad diweddar sy'n dogfennu bod microgrisialau sy'n cynnwys F1 a LcrV yn fwy amddiffynnol na brechlyn tebyg sy'n cynnwys yr antigenau hyn mewn ffurf hydawdd [39]. Mae'r arsylwi hwn yn awgrymu y gallai cynyddu dwysedd yr antigenau, sy'n digwydd yn gynhenid ​​​​yn y polymer F1, wella ac o bosibl gyflymu ymatebion digrif amddiffynnol.

Yn ogystal â'i allu i ysgogi anwythiad cyflym o imiwnedd, mewn arbrofion sy'n mynd i'r afael â hirhoedledd y cyflwr amddiffynnol, cynhyrchodd imiwneiddiad sengl â F1 polymerig titers IgG mwy sefydlog ac unffurf na'r un gyda monomerig F1 (Ffigur 4). Fodd bynnag, roedd brechu â polyF1 yn unig yn darparu amddiffyniad rhannol yn unig yn erbyn clefyd niwmonic. Mae'n werth nodi, roedd cydberthynas wael rhwng y teitrau IgG gwrth-F1 penodol a fesurwyd mewn llygod unigol â'u gallu i oroesi'r her (Ffigur 5B). Cynhyrchodd brechu'r llygod gyda chyfuniad o bob ffurf o F1 ynghyd â LcrV lefelau uwch o amddiffyniad (Ffigur 5). Mae'r canfyddiadau hyn yn unol ag astudiaethau blaenorol a ddangosodd fod brechu gyda'r brechlyn celloedd lladd-gyfan (KWC), sy'n cymell teitrau IgG gwrth-F1 ond nid gwrth-LcrV IgG, yn aneffeithiol wrth ddarparu imiwnedd rhag pla niwmonic [13,40] .

Er bod polyF1, yn yr astudiaeth hirhoedledd, yn darparu imiwnedd hwyr rhannol yn unig, dangosodd y protein hwn y gallu i amddiffyn y llygod yn llawn yn fuan ar ôl y brechiad, gan awgrymu cynnwys mecanweithiau imiwnedd byrhoedlog ychwanegol a gyfrannodd at glirio'r pathogen yn gyflym. arbrofion imiwnedd. Rydym wedi dangos yn ddiweddar bod brechu â straen Y. pestis gwanedig EV76 wedi sbarduno mecanwaith amddiffyn maethol a ddiddymodd fecanweithiau ffyrnigrwydd cyfryngol siderophore y pathogen a oedd yn cystadlu am ïonau haearn sydd ar gael yn y gwesteiwr, gan gyfrannu at gychwyniad cyflym imiwnedd gwrth-bla [ 41]. Gall eglurhad o'r mecanweithiau cefnogol byrhoedlog sy'n cyd-fynd â'r ymateb imiwnedd humoral gwrth-F1 gynorthwyo i ddatblygu brechlynnau gwell yn erbyn pla niwmonig yn ogystal ag yn erbyn clefydau heintus angheuol eraill.

Deunyddiau Atodol:

Gellir lawrlwytho'r wybodaeth ategol ganlynol yn https://https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines11030581/s1, Ffigur S1: Nodweddu pla niwmonig yn dilyn brechiad mewn trwynol o Y. pestis Kim53. Ffigur S2: Nodweddiad isoteip o wrthgyrff gwrth-F1 a gwrth-LcrV yn sera llygod wedi'u brechu. Ffigur S3: Hirhoedledd ymateb serolegol a goroesiad llygod gwrywaidd yn dilyn un brechiad gyda monomerig F1 a F1 polymerig naill ai ar eu pen eu hunain neu gyda LcrV.

Cyfraniadau Awdur:

Cysyniadoli, EM, ac YL; Curadu data, YL; Dadansoddiad ffurfiol, YL; Ymchwiliad, MA, AT, DG, YV, AZ, ac YL; Methodoleg, YL; Adnoddau, TH, ac AM; Goruchwyliaeth, EM; Ysgrifennu - drafft gwreiddiol, EM, ac YL; Ysgrifennu — Adolygu a golygu, TC, EM, ac YL Mae pob awdur wedi darllen a chytuno i fersiwn gyhoeddedig y llawysgrif.

Ariannu:

Ariannwyd yr ymchwil hwn gan Sefydliad Israel ar gyfer Ymchwil Fiolegol, grant rhif SB/07.

Datganiad y Bwrdd Adolygu Sefydliadol:

Ddim yn berthnasol.

Datganiad Cydsyniad Gwybodus:

Ddim yn berthnasol.

Datganiad Argaeledd Data:

Mae'r data a gyflwynir yn yr astudiaeth hon ar gael ar gais gan yr awduron cyfatebol.

Gwrthdaro Buddiannau:

Nid yw'r awduron yn datgan unrhyw wrthdaro buddiannau.

Cyfeiriadau

1. Butler, T. Plague, a Heintiau Yersinia Eraill ; Greenough, W., Merigan, TC, Eds.; Cwmni Llyfrau Meddygol Plenum: Efrog Newydd, NY, UDA, 1983.

2. Randremanana, R.; Andrianaivoarimanana, V.; Nikolay, B. ; Ramasindrazana, B.; Paireau, J. ; Deg Bosch, QA; Rakotondramanga, JM; Rahajandraibe, A.S.; Rahelinirina, A.S.; Rakotomanana, F.; et al. Nodweddion epidemiolegol epidemig pla trefol ym Madagascar, Awst-Tachwedd, 2017: Adroddiad achos. Lancet Haint. Dis. 2019, 19, 537–545. [CrossRef]

3. Kugeler, KJ; Staples, JE; Hinckley, AF; Gage, KL; Mead, PS Epidemioleg pla dynol yn yr Unol Daleithiau, 1900-2012. Yn dod i'r amlwg. Heintio. Dis. 2015, 21, 16–22. [CrossRef]

4. Kugeler, KJ; Mead, PS; Campbell, SB; Nelson, CA Patrymau Triniaeth Gwrthficrobaidd a Chanlyniad Salwch Ymhlith Cleifion â Phla yr Unol Daleithiau, 1942-2018. Clin. Heintio. Dis. 2020, 70, S20–S26. [CrossRef]

5. Godfred-Cato, A.S.; Cooley, KM; Fleck-Dderderian, A.S.; Becksted, HA; Russell, Z.; Meaney-Delman, D.; Mead, PS; Nelson, CA Trin Pla Dynol: Adolygiad Systematig o Ddata Cyfunol Cyhoeddedig ar Effeithlonrwydd Gwrthficrobaidd, 1939–2019. Clin. Heintio. Dis. 2020, 70, S11–S19. [CrossRef]

6. Galimand, M. ; Guiyoule, A. ; Gerbaud, G.; Rasoamanana, B.; Chanteau, A.S.; Carniel, E.; Courvalin, P. Gwrthiant amlgyffuriau yn Yersinia pestis wedi'i gyfryngu gan plasmid trosglwyddadwy. N. Saesneg. J. Med. 1997, 337, 677–680. [CrossRef]

7. Welch, TJ; Fricke, WF; McDermott, PF; Gwyn, DG; Rosso, ML; Rasko, DA; Mammel, MK; Eppinger, M.; Rosovitz, MJ; Wagner, D.; et al. Ymwrthedd gwrthficrobaidd lluosog mewn pla: Risg iechyd cyhoeddus sy'n dod i'r amlwg. PLoS ONE 2007, 2, e309. [CrossRef]

8. Lei, C. ; Kumar, S. Yersinia ymwrthedd i wrthfiotigau pestis: Adolygiad systematig. Osong Iechyd Cyhoeddus Res. Safbwynt. 2022, 13, 24–36. [CrossRef]

9. Zauberman, A.; Gur, D.; Ardoll, Y. ; Aftalion, M. ; Vagima, Y. ; Tidhar, A. ; Chitlaru, T.; Mamroud, E. Ôl-Amlygiad Brechlyn Byw Yersinia pestis er Potensial Triniaeth Wrthfiotig Ail-Lein Yn Erbyn Pla Niwmonaidd. J. Heintio. Dis. 2019, 220, 1147–1151. [CrossRef]

10. Vagima, Y. ; Gur, D.; Aftalion, M. ; Moses, A.S.; Ardoll, Y. ; Makovitzki, A.; Holtzman, T.; Oren, Z. ; Segula, Y. ; Fatelevich, E.; et al. Mae Therapi Phage yn Gallu Triniaeth Wrthfiotig Ail-Lein yn erbyn Pla Niwmonig. Firysau 2022, 14, 688. [CrossRef]

11. ardoll, Y. ; Flashner, Y.; Tidhar, A. ; Zauberman, A.; Aftalion, M. ; Lasar, A.S.; Gur, D.; Shafferman, A.; Mae celloedd Mahmoud, E. T yn chwarae rhan hanfodol mewn amddiffyniad cyflym cyfryngol gwrth-F1 yn erbyn pla bubonig. Brechlyn 2011, 29, 6866–6873. [CrossRef]

12. Ardoll, Y. ; Vagima, Y. ; Tidhar, A. ; Aftalion, M. ; Gur, D.; Nili, U.; Chitlaru, T.; Zauberman, A.; Mahmoud, E. Mae targedu antigen capsiwlaidd Yersinia pestis F1 gan gelloedd B1b cynhenid ​​​​fel yn cyfryngu ymateb amddiffynnol cyflym yn erbyn pla bubonig. Brechlynnau NPJ 2018, 3, 52. [CrossRef]

13. Williamson, ED; Stagg, AJ; Eley, SM; Taylor, R.; Gwyrdd, M. ; Jones, SM; Titball, RW Kinetics o'r ymateb imiwn i'r brechlyn (F1 plws V) mewn modelau o bla bubonig a niwmonic. Brechlyn 2007, 25, 1142–1148. [CrossRef]

14. Holtzman, T.; Ardoll, Y. ; Marcus, D.; Flashner, Y.; Mamroud, E. ; Cohen, A.S.; Fass, R. Cynhyrchu a phuro oligomers pwysau moleciwlaidd uchel o antigen capsiwlaidd Yersinia pestis F1 a ryddhawyd gan ddiwylliant dwysedd celloedd uchel o gelloedd Escherichia coli ailgyfunol sy'n cario'r caf1 operon. Microb. Ffatrïoedd Celloedd 2006, 5, P98. [CrossRef]

15. Chalton, DA; Musson, JA; Flick-Smith, H.; Walker, N.; McGregor, A.; Oen, HK; Williamson, ED; Miller, J.; Robinson, JH; Lakey, JH Imiwnogenigrwydd antigen brechlyn Yersinia pestis wedi'i fonomereiddio gan drynewidiad cylchol. Heintio. Imiwn. 2006, 74, 6624–6631. [CrossRef]

16. Petsch, D.; Anspach, FB Tynnu endotoxin o doddiannau protein. J. Biotechnol. 2000, 76, 97–119. [CrossRef]

17. Leary, SE; Williamson, ED; Griffin, KF; Russell, P.; Eley, SM; Titball, RW Mae imiwneiddio gweithredol ag antigen V ailgyfunol o Yersinia pestis yn amddiffyn llygod rhag pla. Heintio. Imiwn. 1995, 63, 2854–2858. [CrossRef]

18. Mechaly, A. ; Vitner, EB; Ardoll, Y. ; Gur, D.; Barlev-Gross, M.A.; Sittner, A. ; Koren, M.; Ardoll, H. ; Mahmoud, E.; Fisher, M. Epitope Binning Anti Monoclonal Anti F1 a Anti LcrV Antibodies a Eu Cymhwyso mewn Prawf Syml, Byr, HTRF ar gyfer Canfod Pla Clinigol. Pathogenau 2021, 10, 285. [CrossRef]

19. Tidhar, A. ; Flashner, Y.; Cohen, A.S.; Lefi, Y.; Zauberman, A.; Gur, D.; Aftalion, M. ; Elhany, E.; Zvi, A. ; Shafferman, A.; et al. Mae lipoprotein NlpD yn ffactor ffyrnigrwydd Yersinia pestis sy'n hanfodol ar gyfer datblygiad pla. PLoS ONE 2009, 4, e7023. [CrossRef]

20. Reed, LJ; Muench, H. Dull Syml o Amcangyfrif Hanner Canran o Bwyntiau Terfyn12. Yn. J. Epidemiol. 1938, 27, 493–497. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com