Patrwm Mynegiant -Tiwbwlin, Inversin A'i Darged Wedi'i Ddisgelu-1 A Morffoleg Cilia Sylfaenol yn natblygiad arferol yr Arennau Dynol A Chlefydau
Mar 10, 2022
Crynodeb:Wrth ddatblygu, dadansoddwyd mynegiant spatiotemporal -tubulin, gwrthdroad, a phroteinau anesmwyth-1 (DVL-1) sy'n gysylltiedig â llwybr signalau Wnt, a morffoleg cilia cynradd.arennau(14eg-38ain wythnos datblygiadol), ôl-enedigol iach (1.5- a 7-mlwydd oed), a dynol wedi newid yn patholegolarennau,gan gynnwys dysplastig amlsystigarennau(MCDK), glomerulosclerosis segmentol ffocal (FSGS) a syndrom nephrotic o'r math Ffindir (CNF). Perfformiwyd y dadansoddiad trwy imiwnofflworoleuedd dwbl, microsgopeg electron, dulliau lled feintiol ac ystadegol. Arsylwyd cyd-fynegiant cytoplasmig o -twbwlin, gwrthdroad, a DVL-1 yn y tiwbiau troellog procsimol (pct), tiwbiau troellog distal (dct), a glomeruli (g) o feinweoedd a ddadansoddwyd. Yn ystodarendatblygiad, gostyngodd mynegiant cyffredinol -tubulin, gwrthdroad, a DVL, tra yn y cyfnod ôl-enedigol wedi cynyddu ychydig. Roedd yr ymadroddion uchaf o -tubulin a gwrthdroad yn nodweddu dct a g, tra bod DVL uchel-1 yn nodweddu pct. -tubulin, gwrthdroad, a phatrymau mynegiant DVL-1 yn MCDK, FSGS, a CNFarennauyn wahanol iawn i'r rheolaeth iach. O'i gymharu ag iacharennau, wedi'i newid yn patholegolarennauwedi cael cilia cynradd dysmorffig. Deinameg mynegiant gwahanol o -tubulin, gwrthdroad, a DVL-1 yn ystodarengallai datblygiad ddangos bod newid rhwng y signal Wnt canonaidd ac anganonaidd yn hanfodol ar gyfer normalarenmorffogenesis. Mewn cyferbyniad, mae eu mynegiant cynhyrfus yn patholegolarennaugallai fod yn gysylltiedig â cilia sylfaenol annormal, gan arwain at gronigafiechydon yr arennau.
Geiriau allweddol:datblygiad yr arennau dynol; -twbwlin; gwrthdro; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; aren, arenol
BYDD CISTANCHE YN GWELLA CLEFYD YR AREN/ARENAU
Rhagymadrodd
Datblygiad y diffiniol neu fetaneffrigarennauyn dechrau yn ystod y bumed wythnos beichiogrwydd (GW), sydd wedyn yn gwahaniaethu'n barhaus i ffurfio'r arennau parhaol [1,2]. Mae'r rhyngweithiadau signalau rhwng y mesenchyme metaneffrig a'r blaguryn wreterig yn sicrhau cywirarendatblygiad yn ystod nephrogenesis. Yn fyr, mae'r blaguryn wreterig yn achosi trawsnewid mesenchymal-i-epithelial (MET) yn y mesenchyme metaneffrig, sy'n cyddwyso ac yn ffurfioarennolfesiglau, ac yna cyrff siâp coma a siâp S, ac yn olaf yn arwain at ffurfio glomeruli [3]. Yn gyfnewid, mae'r mesenchyme yn achosi canghennog pellach o'r blaguryn wreterig. Mae'r arennau metaneffrig yn dod yn unedau ysgarthol swyddogaethol ar yr 11eg wythnos o ddatblygiad dynol. Fodd bynnag, cwblheir nephrogenesis o fewn y 34ain i 36ain wythnos o ddatblygiad y ffetws, pan ddaw digwyddiadau canghennog lluosog i ben, ond mae proses wahaniaethu arennau pellach yn parhau i'r cyfnod ôl-enedigol [4,5]. Mae tarfu ar y rhyngweithiadau cymhleth hyn yn arwain at annormaleddau cynhenid amrywiol yn y llwybr arennau a'r llwybr wrinol (CAKUT), gan gynnwys dysplasia, clefyd yr arennau polycystig, dysplastig amlsystig.clefyd yr arennau(MCDK), gan arwain at gronig o ganlyniadclefyd yr arennau(CKD) [6].
Yn yr astudiaeth hon, roeddem yn canolbwyntio ar ymddangosiad cilia cynradd a'r llwybr signalau Wnt, sy'n chwarae rhan bwysig yn ystod nephrogenesis arferol ac yn yarenbroses atgyweirio, yn dilyn acíwt neu gronigclefyd yr arennau[7]. Bodolaeth cilia cynradd yn ystod nephrogenesis a'r nifer fawr o ddatblygiadolarenmae diffygion sy'n digwydd mewn cleifion â chlefyd ciliaraidd yn nodi bod gwir swyddogaeth cilia sylfaenol yn angenrheidiol ar gyfer normalarenorganogenesis [8,9]. Mae'r cilium cynradd yn organelle sy'n seiliedig ar ficrotiwbwl sy'n bwysig ar gyfer homeostasis meinwe, lle mae -tubulin yn gydran sylfaenol [10]. Mae colli asetyleiddiad -tubulin mewn celloedd anfarwol yn sbarduno'r trawsnewidiad epithelial-i-mesenchymal (EMT), gan awgrymu bod asetylated -tubulin yn bwysig wrth sefydlogi microtiwbylau [11]. Yn ystod datblygiad dynol, mae'r llwybr Wnt cilia sylfaenol yn galluogi amlhau celloedd, gwahaniaethu a morffogenesis meinwe [12]. Mae nifer sylweddol o blant sydd â nam ar eu swyddogaeth cilia sylfaenol ac amharwyd ar eu llwybr signalau Wnt yn datblygu CKD, lle mae'r clefyd yn gynhenid.arennolanhwylderau sy'n gyfrifol am bron i hanner yr achosion [13]. Y clefyd systig cynhenid mwyaf cyffredin mewn plant yw dysplastig amlsystigclefyd yr arennau(MCDK) [14]. Codennau lluosog nad ydynt yn cyfathrebu [15] ac sydd â diffyg normalarennolMae parenchyma yn ganfyddiadau microsgopig nodweddiadol ar gyfer MCDK. Mae glomerwlosclerosis segmentol ffocal (FSGS) yn un o'r clefydau glomerwlaidd mwyaf cyffredin sy'n arwain at y cam olaf.clefyd yr arennau[16]. Yn y dechrau, mae FSGS yn nodweddiadol o fod yn ganolbwynt, sy'n cynnwys dim ond lleiafrif o'r glomeruli a segmentol, sy'n cynnwys newidiadau mewn dim ond segment o'r cylch glomerwlaidd [17]. Mae syndrom nephrotic cynhenid o'r math Ffindir (CNF) yn awtosomaidd anghyffredin a etifeddwyd yn enciliolclefyd yr arennaua gynrychiolir gan achos cyn-geni o golled protein helaeth [18], sy'n gysylltiedig â cystogenesis tiwbynau procsimol [19]. Mae llawer o fathau o glefydau glomerwlaidd cynradd yn datblygu proteinwria o ganlyniad i'r rhwystr hidlo glomerwlaidd difrodi [20]. Mae cryn dipyn o astudiaethau'n awgrymu bod gan anafiadau a chamweithrediad y podocytes rolau cynhenid yn pathogenesis proteinwria CKD [21]. Mae astudiaeth gan Vukojevic et al. yn dangos nifer gynyddol o podocytau ciliedig a gwahaniaethol yn CNF [22]. Nododd astudiaethau blaenorol fod gan lwybr signalau Wnt/ -catenin rôl sylfaenol wrth gymedroli camweithrediad podocyte â phroteinwria [23]. Mae dau brif lwybr signalau Wnt, un a elwir yn ganonaidd - catenin-ddibynnol ac anganonaidd arall, -catenin annibynnol. Yn ystod llygodenarendatblygiad, mae Wnt-signal canonaidd yn weithredol ar y blaenau blagur wreterig ac mewn cyrff siâp S [24]. Ar ben hynny, mae Wnt trwy signalau canonaidd yn berthnasol wrth gynnal MET yn ystod nephrogenesis [25]. Sef, mae rhwymo'r cymhleth protein sy'n cynnwys Dvl i'r derbynnydd pilen yn orfodol ar gyfer gweithrediad llwybr Wnt, tra bod analluogi cydrannau allweddol y llwybr hwn yn arwain at farwolaethau amenedigol cynnar oherwydd absenoldeb y parth neffrogenig yn yaren[25].
Canfuwyd bod protein hanfodol fel switsh moleciwlaidd rhwng llwybrau signalau Wnt canonaidd ac anganonaidd yn wrthdroad [26]. Er bod rhyngweithiadau proteinau amrywiol â gwrthdroad wedi'u canfod, nid yw ei union swyddogaeth wedi'i egluro'n llwyr eto. Yn yarennolcelloedd epithelial, mae gwrthdroad wedi'i leoli yn y cilia cynradd, gan weithredu fel protein ciliary [27]. Yn ogystal, mae gwrthdroad yn ffurfio cymhleth cyson gyda thubulin mewn diwylliannau oarennolcelloedd, ac maent yn colocalize in vivo [27,28]. Ymddengys bod gwrthdroad yn chwarae rhan hanfodol ym morffogenesis cynnar y system pronephric a phenderfyniad cymesuredd chwith-dde yn ystod datblygiad [29,30]. Digwyddiad arwyddocaol ar gyfer llwybrau signalau Wnt canonaidd ac anganonaidd wrth recriwtio'r Dvl cytoplasmig i'r gellbilen. Gan fod canfyddiadau blaenorol yn dangos bod gwrthdroad a Dvl yn cydleoli yn y celloedd epithelial arennol, gellir dyfalu y gallai gwrthdroad hefyd chwarae rhan mewn signalau anganonaidd. Mae dadreoleiddio signalau Wnt wedi'i gyfryngu gan wrthdroad yn sbarduno amlhau afreolaidd mewn tiwbiau [31]. Datgelodd profion genetig fwtaniad DVL-1 mewn cleifion â syndrom Robinow awtosomaidd-dominyddol, gan gyflwyno anhwylderau heterogenaidd mewn rhai cleifion sy'n gysylltiedig â wrogenital aarennolanomaleddau [32].
BYDD CISTANCHE YN GWELLA DIALYSIS AREN/ARENOL
Ymchwiliwyd i batrwm mynegiant datblygiadol -tubulin, gwrthdroad a DVL-1 mewn gwahanol fodelau anifeiliaid. Felly, mae eu mynegiant mewn pronephros o Xenopus laevis wedi'i gadarnhau trwy ddefnyddio microsgopeg intravital [31], tra cawsant eu canfod mewn llinellau celloedd sy'n deillio o gelloedd tiwbaidd murine procsimol trwy ddefnyddio microsgopeg confocal a sbectrometreg màs [33]. Yn ogystal, datgelodd microsgopeg ysgafn a immunofluorescence dwbl eu presenoldeb mewn rhannau o lygodarennau[34]. Adroddodd astudiaethau ar lygod cnocio gwrthdroad chwyddedig, codennau gwasgaredig yn yarennolmedulla a cortecs sy'n gysylltiedig â gwrthdroad visceral situs [35]. Mewn bodau dynol, cyflwynwyd nephronophthisis babanaidd i dreiglad gwrthdroad a arweiniodd at derfynu beichiogrwydd [36]. Er gwaethaf nifer o astudiaethau ararennol-twbwlin, gwrthdroad a phatrwm mynegiant a swyddogaeth DVL-1, hyd y gwyddom ni, nid yw patrwm mynegiant o'r proteinau hyn ym meinwe dynol y ffetws ac ôl-enedigol wedi'i ymchwilio eto ac wedi dod i gydberthynas. Yn ogystal, nid oes tystiolaeth wedi'i hadrodd sy'n ystyried mynegiant gwrthdroad a DVL-1 yn natblygiad dynol cynnar. Felly, nod yr astudiaeth hon oedd dadansoddi patrwm mynegiant gofodol ac amserol -twbwlin, gwrthdroad a DVL-1 yn ystod cyfnodau ffetws ac ôl-enedigol bod dynol iach.arennau, yn ogystal ag ynarenmeinweoedd MCDK, FSGS a CNFarennauer mwyn sefydlu cyswllt coll posibl rhwng yr endidau hyn. Sef, rydym yn cynnig y gallai patrymau mynegiant cythryblus o broteinau -tubulin, gwrthdroad a DVL-1 fod yn broses sytogenesis sylfaenol a swyddogaeth annormal o cilia cynradd sy'n arwain at gronigafiechydon yr arennau.
Canlyniadau
Dadansoddiad o ddatblygiad ac ôl-enedigolarenmeinweoedd ei berfformio ar strwythurau gwahaniaethol amlwg yaren:tiwbyn troellog procsimol (pct), tiwbyn troellog distal (dct) a glomeruli (g). Yn ystod y cyfnodau datblygiadol a ddadansoddwyd ac yn y cyfnod ôl-enedigolarendangosodd meinweoedd, -tubulin, gwrthdroad a DVL-1 batrymau mynegiant cadarnhaol ond gyda gwahaniaethau mewn dwyster, dosbarthiad a maint. Mae dadansoddiad o'r patholegolmeinwe arennauo MCDK, FSGS a CNF ei berfformio ar gyfrif delwedd llawn o'r celloedd positif o gymharu â rheolaeth iach meinwe arennau.
2.1. Microsgopeg Ysgafn, Microsgopeg Electron ac Imiwnohistocemeg (-Tubulin) Meinwe Arennau Dynol Ôl-enedigol Iach a Newidiwyd yn Patholegol
2.1.1. Golau Arennau Ôl-enedigol Iach
microsgopeg y cyfnod ôl-enedigolarenmeinwe yn dangos wedi'i ddiffinio'n ddaarenstrwythurau, gyda gwahaniaeth amlwg rhwng medulla a cortecs a ffurfio'r pct, dct, a g yn y rhanbarth cortigol. Mae staenio imiwnohistocemegol o -tubulin yn datgelu presenoldeb un ciliwm cynradd yng nghanol arwyneb celloedd apical pob cell tiwbaidd ac yn 0.018 y cant ± 0.00014 y cant SD ar wyneb celloedd glomerwlaidd. Mae microsgopeg electron yn dangos presenoldeb dim ond un siliwm cynradd sy'n deillio o'r corff gwaelodol ar arwyneb cell apical y tiwbyn (Ffigur 1a).
2.1.2. CNF
Mae'r rhan fwyaf o'r g a ddadansoddwyd yn llai ac yn lobïo (80 y cant ), tra bod y lleiafrif o faint normal neu'n hypertroffig (20 y cant , n=100). Canfyddir sglerosis segmentol neu fyd-eang o g, tra bod pct a dct wedi'u hamledu'n rhannol a'u gorchuddio ag epitheliwm atroffig. Yn uwch-strwythurol, gwelir colli microfili a gostyngiad yn uchder celloedd gydag aml-ddarnio niwclysau. Mewn podocytes, mae prosesau traed yn cael eu colli'n wasgaredig. Mae cilia cynradd tiwbaidd yn anhrefnus, yn enwedig yn systiau'r tiwbynau procsimol, gan ddangos newidiadau mewn hyd a safle cytoplasmig (Ffigur 1b).
2.1.3. MCDK
Mewn meinwe arennol, gellir dod o hyd i g anaeddfed ac aeddfed achlysurol.Arennaumae meinwe wedi'i llenwi â systiau hirgrwn niferus. Mae celloedd epithelial colofnol yn gorchuddio'r codennau ac wedi'u hamgylchynu gan feinwe gyswllt llac. Mae staenio imiwnohistocemegol i -tubulin yn dangos cilia cynradd hir ac anhrefnus lluosog ar wyneb y celloedd epithelial (Ffigur 1c).
2.1.4. FSGS
Mewn 90 y cant o g, canfyddir sglerosis segmentol helaeth (n=100), sy'n gysylltiedig â ffibrosis interstitial ac arwyddion o ddifrod tiwbaidd. Mae'r gostyngiad yn uchder celloedd epithelial â cholli microvilli i'w weld yn y microsgop electron, tra bod gan gelloedd endothelaidd a rhanbarthau mesangial uwch-strwythur rheolaidd. Yn y microsgop electron, gwelir y ciliwm hynod hir a dadleoli (datganoli) ar wyneb y gell tiwbaidd distal (Ffigur 1e). Mae podocytes yn dangos colli gwasgaredig o brosesau traed gyda meinwe microfilws helaeth. Mae staenio imiwnohistocemegol i a-tiwbwlin yn dangos cilia cynradd hir ac anhrefnus lluosog ar wyneb y celloedd epithelial (Ffigur 1c).
2.2. Lliwio imiwnohistocemegol i 心 Tiwbwlin, Gwrthdroad a DVL-1- a Dadansoddiad Ystadegol o Arennau Dynol Ôl-enedigol Datblygol ac Iach
Yn y 14eg, 15fed, a'r 16eg wythnos beichiogrwydd, yarencyflwynir meinwe gyda gwahanol gamau datblygiadol o ffurfio neffron: o gwpanau metaneffrig,arennolcamau fesiglau i orchymyn neffronau siâp S, gan ffurfio'r parth neffrogenig yn y cortecs allanol (Ffigur 2). Gellir arsylwi gwahaniaethu pct, dct a g mewn rhanbarthau cortigol yn agosach at yarenmedwla. Yn ystod yr 22ain GW, daeth rhannau o'r medwlla a'r cortecs yn amlwg yn nodedig, tra yn y 38ain GW,arenmae strwythurau'n ymddangos yn wahaniaethol iawn, yn cynnwys ffurfiau aeddfed o pct, dct a g
2.2.1. a-Tubulin
Yn ystod datblygiad, mynegir a-tubulin yn gryf ym mhob datblygiadarenstrwythurau, yn bennaf yn delweddu ffurf cilia cynradd ar arwynebau celloedd epithelial parietal capsiwl Bowman, g, pct a dct. O fewnarenmeinwe, mae 82-97 y cant o gelloedd pct yn mynegi a-tiwbwlin, tra mewn mynegiant dct yn gostwng o 99 y cant i 72 y cant yn y 38ain GW (gweler Ffigur 3, Tabl 1). Ymhlith gwahanol gamau datblygiadol, ceir y mynegiant cryfaf o a-tiwbwlin yn g yr 16eg GW.arennau, sy'n cynnwys 93 y cant o gelloedd positif. lithe 14eg, 15fed a 22ain GW (gweler Ffigur 3a,b, Tabl 1), mae tua 70 y cant o'r celloedd g yn mynegi a-tiwbwlin, tra bod y mynegiant lleiaf yn cael ei arsylwi yn y 38ain GW (p < 0.01)="" gyda="" 34="" y="" cant="" o'r="" celloedd="" positif="" (ffigur="" 3c).="" yn="" yr="">arenmeinwe (1.5-mlwydd a 7-mlwydd oedarennau), mae'r imiwn-adweithedd cryfaf i a-tubulin i'w weld ar wyneb celloedd apical y pct a dct (Ffigur 3d-f). Mae'r mynegiant a-tiwbwlin hefyd yn bresennol yn cytoplasm periniwclear y dct a chelloedd epithelial parietal capsiwl Bowman. a-tubulin staeniau i gydarennolstrwythurau gyda chymedr o 50 y cant o gelloedd positif mewn pct, 94 y cant mewn dct ac 85 y cant mewn g (Ffigur 3f). Mae staeniau Dct yn sylweddol wahanol i pct (p < 0.0001).="" mae="" pob="" un="" o'r="" strwythurau="" yr="" ymchwiliwyd="" iddynt="" yn="" staenio'n="" bositif="" i="" a-tiwulin,="" gyda="" 77="" y="" cant="" o="" gelloedd="" positif="" yn="" pct,="" 72="" y="" cant="" mewn="" dct="" a="" 58="" y="" cant="" mewn="" g="">
Ffigur 3. Staenio imiwnofflworoleuedd -twbwlin a DAPI yn y meinweoedd arennau dynol sy'n datblygu ac ar ôl geni (a–e). Arennau 14eg, 15fed/16eg, 38ain GW (a–c);arennauo 1.5- a 7-plant blwydd oed (ch,e). Dangosir staenio -tubulin (saethau) yn gadarnhaol ym mhob strwythur yn y cortecs trwy gyfnodau datblygiadol ac ôl-enedigol (a–e), tiwbiau troellog procsimol (pct), tiwbiau troellog distal (dct) a glomeruli (g). Dangosir manylion cilia cynradd yn pct (d) a dct (a–c,e) fel mewnosodiadau chwyddo uwch (blwch gwyn). Chwyddiad ×40, bar graddfa 100 µm. Mae graff (dd) yn dangos dosraniad celloedd positif -Tubulin fesul adeiledd trwy wahanol gamau datblygiad ac yn y cyfnod ôl-enedigol. Mae graff (g) (nifer gyffredinol o gelloedd protein-bositif mewn strwythurau a arsylwyd) yn dangos mynegiant protein sy'n gysylltiedig ag amser datblygiadol (atchweliad llinol) a rhyngberthynas -Tubulin i DVL-1 trwy ddatblygiad ac aeddfediad (ANOVA Ddwy Ffordd ac yna prawf posthoc SIDAK). Dangosir data fel cymedr ± SD.
Mae graff (dd) yn dangos dosraniad celloedd -twbwlin-positif fesul adeiledd trwy wahanol gamau datblygiad ac yn y cyfnod ôl-enedigol. Mae graff (g) (nifer cyffredinol o gelloedd protein-bositif mewn strwythurau a arsylwyd) yn dangos mynegiant protein sy'n gysylltiedig ag amser datblygiadol (atchweliad llinol) a rhyngberthynas -tiwbwlin i DVL-1 trwy ddatblygiad ac aeddfedu (ANOVA dwy ffordd ac yna prawf post hoc Sidak). Dangosir data fel modd ± SD.
2.2.2. Staeniad Immunofflfluorescence Dwbl i Wrthdroad a DVL-1 a Staen Niwclear DAPI wrth Ddatblygu ac Iach ar yr Arennau Ôl-enedigol Mynegiant Gwrthdroad wrth Ddatblygu a Meinwe Arennau Ôl-enedigol
Yn y 14eg, 15fed a'r 16eg GW, mae gwrthdroad yn dangos mynegiant gronynnog cryf yn g, a mynegiant gronynnog ysgafn yn cytoplasm pct a dct (Ffigur 4a, b), tra yn yr 22ain a'r 38ain GW (gweler Ffigur 4c), mae'r cryf gwelir mynegiant positif yn g (Tabl 1). Rhwng y 14eg a'r 22ain GW, mae tua 50 y cant o'r celloedd yn mynegi fersiwn. Yn yr 16eg GW, mae celloedd pct yn mynegi gwrthdroad mewn 73 y cant o gelloedd, tra'n gostwng i 29 y cant o'r celloedd (p <0.05) yn="" y="" 38ain="" gw="" (gweler="" ffigur="" 4f).="" ceir="" mynegiant="" cadarnhaol="" o="" wrthdroad="" mewn="" tua="" 80-90="" y="" cant="" o'r="" celloedd="" dct="" ac="" g="" yn="" y="">arenmeinweoedd y 14eg a'r 16eg GW, gyda'r mynegiant isaf yn dct o 38th GW (p < 0.05,="" p="">< 0.0001,="" yn="" y="" drefn="" honno)="" lle="" roedd="" 66="" y="" cant="" o'r="" celloedd="" yn="" bositif.="" yn="">arennau, mae pct yn staenio'n gryf ar y gellbilen apical, tra bod dct yn staenio'n bennaf ar y gellbilen waelodol ac yn y cytoplasm periniwclear (Ffigur 4d, e). Bryd hynny, canfuom fynegiant o wrthdroad ym mhob un yr ymchwiliwyd iddoarennolstrwythurau, gan gynnwys pct, dct ac g, gyda mynegiant cymedrig o gelloedd positif o 92 y cant ar gyfer pct, 88 y cant ar gyfer dct a 90 y cant ar gyfer g (Ffigur 4f). Ni welsom wahaniaeth sylweddol yng nghryfder signal mynegiant gwrthdroad rhwng strwythurau. Ceir y mynegiant uchaf o wrthdroad yn g, gyda chymedr o 94 y cant o gelloedd positif (Ffigur 4f). Ceir gwahaniaeth sylweddol yn cymharu staenio g (lle mae 94 y cant o gelloedd yn staenio'n bositif) i pct, lle mae 58 y cant o gelloedd yn staenio'n bositif (p < 0.01)="" ac="" i="" dct,="" lle="" mae="" 49="" y="" cant="" o="" gelloedd="" yn="" staenio'n="" bositif.="" positif="" (p="">< 0.0001,="" ffigur="">
Mynegiant DVL-1 mewn Meinwe Arennau Ddatblygol ac Ôl-enedigol
Gwelir mynegiant ysgafn i gryf o DVL{{{{{0}} yn cytoplasm pct, dct a g yng nghyfnod y ffetws (gweler Ffigur 4a–c, Tabl 1). Yn pct, mae 76-86 y cant o'r celloedd yn mynegi DVL-1 yn y 14eg-22ain GW, tra yn y 38ain GW, mae 57 y cant o gelloedd positif (Ffigur 4g). Yn dct 14eg a 15fed GW, mae 68-70 y cant o'r celloedd yn mynegi DVL-1, yn yr 16eg a'r 22ain GW, mae nifer y celloedd positif yn disgyn i 42–5{{41} } y cant , tra yn y mynegiant GW 38th (p < 0.001),="" yn="" cael="" ei="" arsylwi="" mewn="" 19="" y="" cant="" o="" gelloedd="" dct.="" mae="" mynegiant="" dvl-1="" yn="" cynyddu="" mewn="" g="" drwy="" gydol="" cyfnodau'r="" ffetws:="" yn="" y="" 14eg="" gw,="" mae'n="" 6="" y="" cant,="" tra="" yn="" y="" 15fed,="" 16eg="" a'r="" 22ain="" gw,="" mae'n="" cynyddu="" i="" 10="" y="" cant="" (p="">< 0.01).="" yn="" y="" 38="" gw,="" mae="" 14="" y="" cant="" o'r="" celloedd="" g="" yn="" mynegi="" dvl-1="" (ffigur="" 4="" g).="" yn="" y="" cyfnod="" ôl-enedigol,="" mae'r="" imiwn-adweithedd="" dvl-1="" wedi'i="" wasgaru="" yn="" y="" cytoplasm="" (tabl="" 1)="" o="" pct="" a="" dct="" (ffigur="" 4d,e).="" mae'r="" signal="" i'w="" gael="" yn="" yr="" holl="" strwythurau="" a="" archwiliwyd="" ond="" yn="" bennaf="" yn="" y="" cytoplasm="" periniwclear.="" mae="" dwyster="" mynegiant="" dvl-1="" yn="" sylweddol="" uwch="" mewn="" pct="" o="" gymharu="" â="" dct="" a="" g="" (p="">< 0.01).="" mae="" 39-45="" y="" cant="" o'r="" celloedd="" yn="" y="" pct="" a="" dct="" yn="" mynegi="" dvl-1,="" tra="" yn="" g,="" mae="" 21="" y="" cant="" o'r="" celloedd="" yn="" bositif="" (ffigur="" 4="" g).="" ni="" welsom="" wahaniaeth="" sylweddol="" rhwng="" canran="" y="" celloedd="" imiwnyddol="" mewn="">arennolstrwythurau. Canran y celloedd imiwn-adweithiol DVL-1 yw 34 y cant mewn pct, 36 y cant mewn dct a 27 y cant mewn g, yn y drefn honno (Ffigur 4g).
Ffigur 4. Staeniad immunofluorescence dwbl o wrthdroad (gwyrdd), DVL-1 (coch) a DAPI (glas) yn y meinweoedd arennau sy'n datblygu ac ar ôl geni (14eg–38ain GW, 1.5- a {{6} }}meinweoedd arennau blwydd oed). Dangosir staenio cadarnhaol (saethau) ym mhob strwythur trwy gydol pob cyfnod o ddatblygiad (a–c) a'r cyfnod ôl-enedigol (d,e). Meicroffonau cyfun ynghyd â strwythurau o ddiddordeb mewn cortecs: tiwbiau troellog procsimol (pct), tiwbiau troellog distal (dct) a glomeruli (g). Dangosir cydleoliad gwrthdroad/DVL-1 (pen saeth) mewn microffotograffau cyfun. Dangosir staeniau rheoli negyddol fel mewnosodiadau ar wrthdroad a DVL-1 (a). Gellir gweld erythrocytes fel celloedd sydd wedi'u staenio'n gryf ger dct. Dangosir y manylion fel mewnosodiadau chwyddo uwch. Chwyddiad ×40, bar graddfa 100 µm. Dangosir dosraniad celloedd positif dynamig gwrthdroad a DVL-1 mewn strwythurau arennau (pct, dct, g) trwy gydol y cyfnodau datblygu ac ôl-enedigol mewn graffiau (f,g). Mae graff (h) yn dangos mynegiant protein (nifer cyffredinol o gelloedd positif mewn adeileddau) yn ymwneud ag amser datblygiadol (atchweliad llinol) a rhyngberthynas gwrthdroad i DVL-1 trwy ddatblygiad ac aeddfedu (ANOVA dwy ffordd ac yna prawf post hoc Sidak ). Dangosir data fel modd ± SD.
Gwelir cydfynegiant gwrthdroad a DVL-1 yn cytoplasm yr aren g, dct a pct yn ystod datblygiad (gweler Ffigur 4a–c, uno). Yn y cyfnod ôl-enedigol, mae cydfynegiant gwrthdroad a DVL-1 yn nodweddu gwahanol adrannau cellog o gelloedd tiwbaidd mewn pct a dct, tra bod cydfynegiant yn g yn cael ei nodweddu gan gyffredinrwydd cryf mynegiant gwrthdroad (gweler Ffigur 4d, uno ). Yn y 7-flwyddyn arennau ôl-enedigol, gwelir cydfynegiant gwrthdroad a DVL-1 yng nghelloedd tiwbaidd dct a pct, ac mewn g lle mae mynegiant gwrthdroad ychydig yn drech o gymharu â DVL-1 (Ffigur 4e, uno).
2.2.3. Gwahaniaethau o ran Mynegiant -Tiwbwlin, Gwrthdroad a DVL-1 rhwng Gwahanol Gamau Datblygiadol Arennau ac Arennau Ôl-enedigol
Roedd nifer y celloedd -twbwlin-positif mewn pct o feinwe'r arennau ffetws yn arwyddocaol uwch yn ystadegol o gymharu â 7-meinwe arennau plant blwydd oed (13eg (p < 0.0).="" {11}}1),="" 15fed="" (p="">< 0.0001)="" a="" 16eg="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" roedd="" gan="" dct="" o="" gamau="" cynnar="" y="" ffetws="" (13eg,="" 15fed,="" 16eg="" a="" 22ain="" gw)="" gelloedd="" mwy="" cadarnhaol="" o="" gymharu="" â'r="" 38ain="" gw="" a'r="" 1.5-meinwe="" arennau="" plant="" oed="" (p="">< 0.0001,="" yn="" y="" drefn="" honno,="" ffigur="" 3f).="" pan="" gymharwyd="" gwahanol="" gamau="" datblygiadol,="" canfuom="" lefelau="" is="" o="" fynegiant="" gwrthdroad="" yn="" pct="" y="" 13eg="" (p="">< 0.0001),="" 15fed="" (p="">< 0.00001),="" 22ain="" (p="">< 0.001)="" a="" 38ain="" (p="">< 0.0001)="" gw="" o="" gymharu="" â="">arennolmeinwe gan y plentyn 1.5-mlwydd-oed. Mewn dct, canfuwyd mynegiant ystadegol is o wrthdroad yn cymharu meinwe arennau 16eg GW i 38 GW (p < 0.0001).="" ymhellach,="" gwelwyd="" mynegiant="" is="" o="" wrthdroad="" mewn="" dct="" ym="" meinwe="" arennau="" plentyn="" 7-mlwydd-oed;="" cymharu="" 13eg,="" 15fed="" (p="">< 0.001,="" y="" ddau),="" 16eg="" ac="" 1.5-meinwe="" arennau="" oed="" i="" dct="" o="" 7-meinwe="" arennau="" oed="" (p="">< 0.00001,="" yn="" y="" drefn="" honno,="" ffigur="" 4f).="" datgelodd="" y="" signal="" a="" arsylwyd="" o="" fynegiad="" dvl-1="" trwy'r="" gwahanol="" gamau="" fod="" pct="" y="" 13eg="" (p="">< 0.01),="" 15fed,="" 16eg="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">
2.2.4. Perthynas rhwng Mynegiadau o -Tubulin a Gwrthdroad i DVL-1 mewn Meinwe Arennau Datblygol ac Ôl-enedigol
-Cafodd ymadroddion tubulin a gwrthdroad eu cymharu â mynegiant DVL-1 trwy gydol y cyfnodau datblygiadol ac ym meinwe'r arennau ôl-enedigol. -twbwlin gyda mynegiant ystadegol uwch ym mhob cam a arsylwyd, o'i gymharu â mynegiant DVL-1 (p < 0.001,="" ffigur="" 3g).="" trwy'r="" holl="" gamau="" a="" arsylwyd,="" roedd="" gan="" wrthdroad="" fynegiant="" uwch="" o'i="" gymharu="" â="" dvl-1="" (p="">< 0.0001,="" ffigur="" 4="">
2.2.5. Cymharu Lliwio Imiwnohistocemegol â -Tiwbwlin, fersiwn a DVL-1- a Dadansoddiad Ystadegol o feinwe'r Arennau a Newidiwyd yn Patholegol (MCDK, CNF, FSGS) -Tiwbwlin Roedd gwahaniaeth staenio -tiwbwlin yn MCDK, FSGS a CNF yn ystadegol arwyddocaol o'i gymharu i feinwe arennau ôl-enedigol iach fel grŵp rheoli (p < 0.0001,="" yn="" y="" drefn="" honno).="" roedd="" gan="" feinweoedd="" arennau="" dysplastig="" fynegiant="" sylweddol="" uwch="" o="" gymharu="" â'r="" grŵp="" rheoli,="" tra="" bod="" fsgs="" a="" cnf="" yn="" dangos="" mynegiant="" sylweddol="" is="" o="" -tubulin="" o'i="" gymharu="" â="" rheolaeth="" iach="" (ffigur="">
Gwrthdroad
Mynegir gwrthdroad yn cytoplasm celloedd epithelial anhrefnus a thiwbiau MCDK (Ffigur 5a). Yn CNF, mae mynegiant gwrthdroad yn nodweddu g a dct, tra ei fod yn dangos yn llai dwys mewn codennau pct (Ffigur 5b). Yn FSGS, mynegir gwrthdroad yn gryf mewn g a dct ond yn llai dwys mewn codennau pct (Ffigur 5c). Dangosodd mynegiant gofodol gwrthdroad gyfradd staenio uwch arwyddocaol yn ystadegol mewn meinweoedd arennau iach (Ffigur 5g) o'i gymharu â MCDK, FSGS a CNF (p < 0.0001,="" yn="" y="" drefn="">
Ffigur 5. Staeniad immunofluorescence dwbl o wrthdroad (gwyrdd), DVL-1 (coch) a DAPI (glas) mewn meinweoedd arennau patholegol yn MCDK (a), CNF (b) a FSGS (c): tiwbiau (t) , glomeruli (g), cyst pct (c), uchder celloedd epithelial pct (*). Dangosir adeiledd a chydleoli celloedd gwrthdroad a DVL-1 (penawdau saethau) yn yr adrannau cyfun gyda manylion mewn mewnosodiadau chwyddo uwch. Dangosir staeniau rheoli negyddol fel mewnosodiadau ar wrthdroad a DVL-1 (a). Chwyddiad ×40, bar graddfa 10{{20}} µm. Perthynas -tubulin (d) a gwrthdroad (e) â mynegiant DVL-1 yn MCDK, FSGS a CNF (ANOVA dwy ffordd ac yna prawf post hoc SIDAK). Y gwahaniaeth yn uchder celloedd epithelial (f) o FSGS, CNF a MCDK pct o'i gymharu â rheolaeth iach (ANOVA un ffordd ac yna prawf post hoc Tukey, n=50). Y gwahaniaeth yng nghanran celloedd positif cyffredinol -tubulin, gwrthdroad a DVL-1 yn MCDK, CNF a FSGS o gymharu â rheolaeth iach (g–i), ANOVA unffordd ac yna prawf post hoc Tukey). Dangosir data fel modd ± SD. Nodir gwahaniaethau sylweddol gan werth-p (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ****="" p="">< 0.0001).="" dim="" ond="" mewn="" tiwbiau="" anhrefnus="" o="" mcdk="" y="" mynegir="" dvl-1="" dvl-1,="" tra="" yn="" cnf,="" mae="" ei="" fynegiant="" yn="" nodweddu="" dct="" a="" g="" (ffigur="" 5a,b).="" yn="" fsgs,="" gwelir="" dvl-1="" fel="" adweithedd="" ysgafn="" mewn="" g,="" dct="" a="" pct="" (ffigur="" 5c).="" dangosodd="" meinweoedd="" arennau="" iach="" wedi'u="" staenio="" i="" dvl-1="" gyfradd="" sylweddol="" uwch="" o="" staenio="" (ffigur="" 5="" h)="" o'i="" gymharu="" â="" mcdk="" ac="" i="" fsgs="" (p="">< 0.0001,="" y="" ddau),="" tra="" na="" chanfuwyd="" unrhyw="" wahaniaeth="" arwyddocaol="" ar="" gyfer="">
2.2.6. Perthynas rhwng Mynegiadau o -Tubulin a Gwrthdroad i DVL-1 mewn Meinwe Arennau a Newidiwyd yn Patholegol (MCDK, CNF, FSGS)Yn MCDK, FSGS a CNF, mae -tubulin wedi'i staenio'n sylweddol uwch na DVL-1 (p < 0.0001,="" yn="" y="" drefn="" honno,="" ffigur="" 5d).="" roedd="" staen="" gwrthdroad="" yn="" sylweddol="" uwch="" o'i="" gymharu="" â="" dvl-1="" yn="" mdck="" (p="">< 0.0001)="" ac="" yn="" fsgs="" (p="">< 0.01,="" ffigur="">
2.2.7. Gwahaniaethau yn Uchder Celloedd Epithelial y Tiwbiau Cywasgedig Agosol rhwng Rheolaeth Iach a Meinwe Arennau Wedi'i Newid yn Patholegol (MCDK, CNF, FSGS)Cymharwyd uchder celloedd epithelial pct (n {{0}} fesul grŵp) rhwng celloedd tiwbyn mewn meinweoedd arennau iach a meinweoedd arennau a newidiwyd yn patholegol (Ffigur 5b,c,f). Uchder celloedd epithelial cymedrig yn HC oedd 12.91 µm ± 1.847 µm ac roedd yn sylweddol uwch o'i gymharu â CNF a FSGS (p < 0.0001,="" yn="" y="" drefn="" honno).="" uchder="" celloedd="" cymedrig="" yn="" cnf="" pct="" oedd="" 9.011="" µm="" ±="" 1.453="" µm,="" tra="" yn="" fsgs="" oedd="" 8.114="" µm="" ±="" 0.9248="" µm.="" ni="" ddangosodd="" celloedd="" epithelial="" pct="" o="" mcdk="" newidiadau="" sylweddol="" mewn="" uchder="" (12.17="" µm="" ±="" 1.476="" µm)="" o="" gymharu="" â="">
2.2.8. Gwahaniaethau mewn Hyd Cilia Cynradd Rhwng Rheolaeth Iach a Meinwe Arennau Wedi'i Newid yn Patholegol (MCDK, CNF, FSGS)
Cymharwyd hyd siliwm cynradd (n= 50 fesul grŵp) rhwng HC a meinweoedd yr arennau a newidiwyd yn patholegol (Ffigur 6c). Cafodd meinweoedd arennau iach a MCDK eu staenio â -tubulin i dawelu meddwl penodoldeb staenio -tubulin cilium (Ffigur 6a,b). Mewn meinweoedd arennau iach, roedd ciliwm cynradd yn 5.065 µm ± 1.229 µm o hyd, tra yn MCDK, roedd CNF a FSGS yn sylweddol hirach (t<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>
Trafodaeth
Nod ein hastudiaeth oedd ymchwilio i fynegiant imiwn-histocemegol o a-tiwbwlin, gwrthdroad a DVL-1 mewn ffetwsarennolmeinwe a meinwe arennau ôl-enedigol. Ymhellach, roeddem am archwilio a yw mynegiant a phatrwm staenio a-tiwbwlin, gwrthdroad a DVL-1 yn cael ei aflonyddu mewn gwahanol glefydau arennau o gymharu â rheolaeth iach. Sef, er gwaethaf diddordeb helaeth yr ymchwilwyr eraill ar rôl a-tiwbwlin, gwrthdroad a DVL-1 yn ystod datblygiad yr arennau, mae'r rhan fwyaf o'r astudiaethau blaenorol wedi defnyddio anifeiliaid neu fodelau arbrofol in vitro. Hyd y gwyddom, dyma'r astudiaeth gyntaf a oedd wedi dangos mynegiant a lleoleiddio a-tiwbwlin ynghyd â gwrthdroad a DVL-1 mewn arennau dynol ffetws ac ôl-enedigol, ac a oedd wedi archwilio mynegiant proteinau a grybwyllwyd yn yr arennau. afiechydon, megis MCDK, FSGS a CNF. Fe wnaethom hefyd ddadansoddi newidiadau mewn hyd ac ymddangosiad cilia yn ôl microsgopeg golau ac electron, gan fod ein hastudiaeth flaenorol eisoes wedi nodi y gallai aflonyddwch ciliary fod yn gysylltiedig â sytogenesis yn FSGF a CNF [19].
Yn y llwybr signalau Wnt canonaidd, mae rhwymo ligandau Wnt i dderbynyddion yn recriwtio Dvl [37]. Mae prosesau'r MET a'r llwybr polaredd celloedd planar yn ystod camau cynnar morffogenesis yr arennau yn cael eu rheoli gan signalau Wnt. Trwy gyfryngu llwybr Wnt, mae'r cilia cynradd yn rheoli amlhau celloedd, gwahaniaethu a morffogenesis meinwe [12] trwy drefnu'r cytoskeleton cell a chyfeiriadedd celloedd yn ogystal ag elongation strwythur tiwbaidd [2,38]. Yn ein hastudiaeth, roedd -tubulin, gwrthdroad a DVL-1 i gyd yn bresennol yn adeileddau'r arennau, ac roedd pob un wedi'i gydleoli nid yn unig yn ystod datblygiad arennau'r ffetws ond hefyd ym meinwe'r arennau o'r 1.5- a {{9} }}plant blwydd oed. Mae'r canfyddiadau hyn yn cyd-fynd â gweithrediad y llwybr signalau Wnt y profwyd ei fod eisoes yn digwydd yn ystod tubulogenesis [39]. Yn ogystal, mae ein canlyniadau wedi datgelu bod mynegiant -tubulin a gwrthdroad yn gysylltiedig â DVL-1 a'u bod yn dangos gwahaniaeth ystadegol arwyddocaol rhwng eu patrymau mynegiant. Mae hynny mewn cydberthynas â modelau arbrofol, gan fod treiglad y teulu protein Dvl llawn mewn llygod yn arwain at ddiffyg proses gastrulation, tra bod mwtaniadau nad ydynt yn cynnwys y teulu protein cyfan yn dangos diffygion mewn lleoliad cilia nodal ynghyd â diffygion organau [40] . Roedd canfyddiadau blaenorol yn awgrymu bod gan wrthdroad rôl mewn mudo celloedd yn Xenopus pronephros. Gan fod y segment hwnnw'n cyfateb i ddolen famalaidd Henle a thiwbiau distal, gallai hyn ddangos pwysigrwydd gwrthdroad yn ystod datblygiad yr arennau mewn bodau dynol hefyd [41]. Mewn cytundeb â'r rhagosodiad hwnnw, datgelodd astudiaethau blaenorol y gallai mwtaniad y genyn gwrthdroad arwain at nephronophthisis math 2, sy'n cael ei gyfryngu gan fynegiad DVL annormal [42]. Er bod rôl cilium cynradd yn ddadleuol wrth reoleiddio'r llwybr signalau Wnt, canfuom fod -tubulin yn cydleoli â gwrthdroad a DVL-1 yn y samplau arennau a ddadansoddwyd. Ar ben hynny, nododd astudiaethau blaenorol fod y cilium cynradd ynghyd â gwrthdroad yn rheoleiddio diraddio Dvl trwy ddylanwadu ar lwybr signalau Wnt [43]. Mewn clefydau arennau dynol sy'n gysylltiedig â datblygiad codennau, gwelwyd lleoleiddio annormal a swyddogaeth cilia cynradd [19]. Yn yr un modd, cadarnhaodd yr astudiaeth bresennol hefyd newidiadau morffolegol o ffurfiant cilia cynradd mewn amodau patholegol megis CNF, FSGS a MCDK. Roedd canfyddiadau blaenorol yn cydnabod bod gor-actifadu'r llwybr Wnt canonaidd yn dilyn niwed i'r arennau yn arwain at newidiadau strwythurol anadferadwy i feinwe'r arennau [44]. I'r gwrthwyneb, rhoddwyd y rôl i cilium cynradd o newid o lwybr Wnt canonaidd i lwybr anganonaidd wrth gynorthwyoarennoltrwsio. Ar ben hynny, canfuwyd bod gor-actifadu'r llwybr Wnt canonaidd mewn meinwe arennau wedi'i drawsblannu â gwerth rhagfynegol cadarnhaol tuag at ffibrosis yr arennau [45]. Os yw'r llwybr Wnt canonaidd yn bodoli ar draul anganonaidd, mae'n cefnogi damcaniaeth ffibrosis yr arennau fel y canlyniad. Mae ein canfyddiadau o fynegiant twbwlin is a gwrthdroad yn CNF a FSGS yn awgrymu anweithgarwch y llwybr Wnt anganonaidd, yn enwedig gan fod y ddau gyflwr yn tueddu i arwain at y cam olaf.clefyd arennol.Sef, credir y gallai lleoleiddio arferol a swyddogaeth siliwm cynradd fod yn ffactor wrth gynnal llwybr Wnt rheolaidd ac, felly, yn rhagofyniad ar gyfer datblygiad arferol. Mewn cyferbyniad, os caiff llwybr Wnt ei wella, gall arwain at amlhau a gwahaniaethu celloedd wedi'u dadreoleiddio gan arwain at garcinogenesis [46]. Fel y disgrifiwyd yn flaenorol, mae'r llwybr Wnt canonaidd yn orfodol ar gyfer cychwyn MET a ffurfio'r neffron, tra gallai ei aflonyddwch arwain atarennolhypoplasia [47]. Mae ein canlyniadau yn cefnogi'r syniad hwn trwy ddatgelu'r mynegiant isaf o DVL-1 gyda'r mynegiant uchaf o -tubulin yn MCDK o gymharu â rheolaeth iach. Gall y canlyniadau hyn awgrymu gweithrediad isaf y llwybr Wnt canonaidd, a allai fod yn achos sylfaenol absenoldeb ffurfiant neffron. Mewn cyferbyniad, gallai'r mynegiant tiwbwlin uchaf gyda'r mynegiant DVL-1 isaf esbonio canfyddiadau codennau lluosog gan nad oes unrhyw ehangiad trefnus a phegynu celloedd wedi'u harwain gan y llwybr Wnt anganonaidd. Roedd astudiaethau blaenorol hefyd wedi dangos bod gwrthdroad yn atal llwybr signalau canonaidd Wnt trwy dargedu Dvl ar gyfer diraddio [26]. Canfuwyd bod y cam hwn yn eu rhyngweithiad yn angenrheidiol i atal signalau Wnt canonaidd rhag cynnal ehangiad tiwbaidd arferol a lleoliad. Mae treiglad gwrthdroad yn arwain at uwchreoleiddio signalau Wnt canonaidd, a ysgogodd wedi hynny amlhau annormal mewn celloedd tiwbaidd. Profwyd bod y cam hwn yn hanfodol mewn cystogenesis [42], tra bod gwrthdaro mewn llygod yn arwain at glefyd yr arennau polycystig [48]. Yn ôl y ddamcaniaeth oarennolcystogenesis, gwrthdroad yn cael ei ystyried yn "mycoprotein", oherwydd ei leoleiddio i cilia cynradd ynarennolcelloedd tiwbaidd. Yn ein hastudiaeth, roedd cilia cynradd yn bresennol ar wyneb celloedd apical celloedd tiwbaidd yn yr holl gamau a ddadansoddwyd, tra yn ystod cyfnodau ffetws, roedd mynegiant -tubulin yn gryfach nag yn y cyfnod ôl-enedigol.
BYDD CISTANCHE YN GWELLA POEN YN YR AREN/ARENIAD
Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos y gall camreoli -tubulin effeithio ar swyddogaeth cilia sylfaenol yn ystod datblygiad, a allai arwain at sytogenesis, datblygiad arennau annormal a chlefyd cronig posibl yr arennau yn ystod plentyndod [31,49]. Mae hyn yn unol â'n canfyddiadau o cilia cynradd byrrach a dysmorffig a welwyd yn MCDK neu â cilia lluosog a hynod hirfaith neu ddatgymalog a geir mewn tiwbiau ymledol o CNF a FSGS o'u cymharu â rheolaeth iach. I gefnogi'r ffaith bod y llwybrau signalau Wnt canonaidd ac anganonaidd, a reoleiddir gan cilia cynradd, yn cael eu hystyried yn orfodol ar gyfer datblygiad arferol yr arennau, canfuom staenio sylweddol is o wrthdroad a DVL-1 yn MCDK o'i gymharu â rheolaeth iach. [31,49]. Gall deinameg patrymau mynegiant gwahanol o -twbwlin, gwrthdroad a DVL-1 trwy gydol gwahanol gyfnodau datblygiad yr arennau ddangos newid rhwng y llwybr signalau Wnt canonaidd ac anganonaidd yn ystod morffogenesis arferol yr arennau. Rydym yn awgrymu bod eu cyfnewidfa yn pennu trawsgrifio mewn llwybr canonaidd neu drefn mudo celloedd a phegynu yn ystod datblygiad yr arennau mewn llwybr signalau anganonaidd. Mae eu cydbwysedd a mynegiant yn yr holl strwythurau arennau yr ymchwiliwyd iddynt yn awgrymu eu rôl bwysig yn natblygiad arferol yr arennau. Yn ystod datblygiad arferol yr arennau (o 13eg GW i 38 GW), mae mynegiant cyffredinol -tubulin, gwrthdroad a DVL-1 yn lleihau wrth i feinwe'r arennau ennill morffoleg aeddfed. Mewn meinwe arennau 1.5- a 7-mlwydd-oed, dangosodd -tubulin a gwrthdroad gynnydd bach mewn mynegiant sy'n cefnogi'r ffaith bod y llwybr Wnt anganonaidd yn parhau i fod yn weithredol ar ôl genedigaeth. I'r gwrthwyneb, mae DVL-1 yn parhau â phatrwm mynegiant gostyngol a allai ychwanegu at y casgliad bod llwybr Wnt canonaidd yn cael ei dawelu mewn meinwe arennau iach. O ganlyniad i amodau patholegol yr arennau, gallai celloedd epithelial yr aren adweithio ag ailymddangosiad EMT a ffibrosis [50] sy'n gysylltiedig ag adweithio'r llwybr Wnt canonaidd [44]. Felly, efallai mai tarfu ar -twbwlin, gwrthdroad a DVL-1 a geir mewn arennau heintiedig yw’r mecanwaith patholegol sylfaenol ac o ganlyniad i’r newid o lwybr Wnt anganonaidd i ganonaidd yn yr aren sy’n datblygu gan gyfeirio at y newid rhwng aren cildroadwy i aren anwrthdroadwy. difrod. Ymhellach, newidiadau yn eu cyfnod cyn-geni ac ôl-enedigolarennolgallai patrwm mynegiant fod yn gysylltiedig â nam ar swyddogaeth yr arennau pan fyddant yn oedolion, gan arwain at glefydau cynhenid a methiant cronig yr arennau.
4. Defnyddiau a Dulliau
4.1. Samplau Dynol
Casglwyd samplau o feinwe arennau ffetws ar ôl colli beichiogrwydd ar y 14eg, 15fed, 16eg, 22ain a 38ain GW yn Adran Gynaecoleg ac Obstetreg Rhaniad Canolfan Ysbyty Prifysgol. Archwiliwyd yr holl ddeunydd ffetws a gaffaelwyd gan batholegydd, a dim ond meinweoedd heb arwyddion o annormaleddau, macerations neu farwolaeth fewngroth a gyda karyogram arferol a ddefnyddiwyd ar gyfer yr astudiaeth. Archwiliwyd cofnodion meddygol mamau cyn casglu samplau ac rhag ofn y byddai problemau iechyd a allai ddylanwadu ar ganlyniad beichiogrwydd, ni chynhwyswyd meinweoedd yr arennau o'r astudiaeth. Pennwyd aeddfedrwydd gan gylchedd pen, cylchedd yr abdomen a hyd ffemwr [51] mewn cydberthynas â chalendrau mislif cleifion. Casglwyd sbesimenau o feinwe arennau 1.5- a 7-mlwydd-oed ar ôl marwolaethau damweiniol. Cafwyd y samplau yn Adran Patholeg Rhaniad Canolfan Ysbyty Athrofaol. Cafwyd samplau o feinweoedd amlsystig dysplastig yr arennau (MCDK) ar ôl colli beichiogrwydd, cafwyd glomerwlosclerosis segmentol ffocal (FSGS) a syndrom neffrotig o'r math Ffindir (CNF) oherwydd nephrectomi. Archwiliwyd a gwerthuswyd yr holl ddeunydd a gafwyd gan batholegydd, a ddosbarthodd y diagnosis. Cymeradwywyd protocol yr astudiaeth gan Bwyllgor Moeseg Ysgol Feddygaeth Prifysgol Hollti (20 Mai 2016) yn unol â Datganiad Helsinki a'i ddiweddariadau (rhif dosbarthiad: 003-08/16-03/0001, rhif cofrestrfa: 2181-198-03-04-16-0024, 20 Mai 2016) [52].
4.2. Imiwnohistocemeg
Cafodd gosodiad sampl meinwe a gasglwyd ei brosesu gyda 4 y cant o baraformaldehyd mewn halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) am 24 awr ar 22 ◦C. Ar ôl dadhydradu mewn ethanol 100 y cant, cafodd samplau eu hymgorffori mewn paraffin, fel y disgrifiwyd yn flaenorol [53]. Cafodd sbesimenau eu sleisio'n adrannau 5 µm o drwch gan ddefnyddio microtome ac yna eu gosod ar sleidiau microsgop. Er mwyn gwirio cadw meinwe, cafodd pob 10fed adran ei staenio â hematoxylin ac eosin [54]. Depart- perfformiwyd feminization ac immunohistochemistry fel y disgrifiwyd yn flaenorol [2,55,56]. Ar ôl rinsio yn PBS, roedd sleidiau microsgop yn cael eu deor dros nos gyda gwrthgyrff cynradd mewn siambr llaith ar 22 ◦C (System staenio sleidiau StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, UDA). Gwrthgyrff cynradd a ddefnyddiwyd oedd gwrthgorff tiwbyn gwrth-alffa monoclonaidd cwningen (gwanhau 1:1000; ab179484, Abcam, Caergrawnt, DU), Gwrthgorff Gwrth-wrthdroad Polyclonal Cwningen (gwanedu 1:100; ab65187, Abcam, Caergrawnt, DU), llygoden monoclonaidd DVL -1 gwrthgorff (gwanhad 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, UDA) a gwrthgorff tiwbin gwrth-gama polyclonaidd cwningen (er mwyn gwirio staenio cilia-benodol sylfaenol ag alffa- tubulin, gwanhau 1:500; ab11321, Abcam, Caergrawnt, DU). Ar ôl rinsio yn PBS, gweinyddwyd gwrthgyrff eilaidd am awr fel y rhestrwyd: asyn gwrth-gwningen IgG H&L, Alexa Fluor 488 (gwanhau 1:400; ab150073, Abcam, Caergrawnt, DU) a gwrth-lygoden gafr IgG H&L, TRITC (gwanhau 1:400; ab6786, Abcam, Caergrawnt, DU) 4',6-dimidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) yn cael ei ddefnyddio ar gyfer staenio'r niwclysau ac ar ôl 2-munud deori, sleidiau eu golchi mewn PBS a'u gorchuddio â chyfrwng mowntio a slipiau gorchuddio. Ataliwyd staenio amhenodol trwy ddefnyddio bloc protein (ab64226; Abcam, Caergrawnt, DU) cyn y cais gwrthgyrff cynradd. Fel rheolaeth negyddol, cynhaliwyd prawf arsugniad ymlaen llaw, tra bod manylder y gwrthgyrff eilaidd yn cael ei wirio trwy hepgor y gwrthgyrff sylfaenol o'r gweithdrefnau staenio.
4.3. Microsgopeg Electron
Gosodiad oarenperfformiwyd meinweoedd mewn paraformaldehyde 4 y cant am 24 h, ac yna ôl-osodiad mewn 1 y cant o osmium tetroxide am 1 h. Perfformiwyd y broses dadhydradu gyda chyfres ethanol a'i orffen gyda mewnosod mewn resin LX 112 [22]. Cafodd darnau tenau un-micromedr eu staenio gan ddefnyddio glas toluidine a'u hastudio i ddewis adrannau tra-thin. Archwiliwyd adrannau ultrathin gyda thrwch o 0.05 micromedr ar ôl eu staenio ag asetad wranyl a sitrad plwm. Defnyddiwyd microsgop JEOL 1200 EX i gael y microffotograffau.
4.4. Dadansoddiad Genetig
Fel y disgrifiwyd yn flaenorol [19], gan ddefnyddio leukocytes o'r gwaed ymylol, echdynnwyd DNA genomig. Darganfuwyd mwtaniad homosygaidd missense yn y genyn NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg) yr hyn a gadarnhaodd y diagnosis o syndrom neffrotig cynhenid o'r math Ffindir (CNF) [57].
BYDD CISTANCHE YN GWELLA HEINTIAD YR AREN/ARENAU
4.5. Dadansoddi data
Perfformiwyd y dadansoddiad adran ar ficrosgop fflworoleuedd FL gan ddefnyddio 3 sianel fflworoleuedd FL (Olympus BX51, Tokyo, Japan). Cafodd delweddau eu dal gan gamera digidol DP71 (Olympus, Tokyo, Japan) ar chwyddo pŵer uchel (× 40). Dim ond yarennolroedd cortecs yn cynnwys tiwbiau troellog procsimol (pct), tiwbiau troellog distal (dct) a glomeruli (g) o ddiddordeb. Yna cafodd delweddau eu prosesu gan feddalwedd ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol yr Unol Daleithiau, Bethesda, MD, UDA, https://imagej.nih.gov/ij/ (cyrchwyd ar 15 Hydref 2018), 1997–2021. ) ac Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, California, UDA) i'w gwerthuso ymhellach. Cyn cyfrif celloedd, defnyddiwyd yr offeryn ImageJ sianeli hollti. Wedi hynny, tynnwyd y llun microsgopig immunofluorescence gwreiddiol gan y sianel goch neu wyrdd (yn dibynnu ar beth oedd y sianel wreiddiol) gan ddefnyddio'r offeryn cyfrifiannell delwedd ImageJ i atal gollyngiadau signal. Ystyriwyd gwerthoedd o dan y lefel trothwy 50 yn negyddol. Fe wnaethom gyfrif signalau imiwn-adweithiol mewn celloedd o 20 strwythur o leiaf (pct, dct neu g) fesul cam neu nifer positif cyffredinol o gelloedd fesul llun micro o ddysplastig amlsystigarenmeinwe, FSGS a CNF. Fe wnaethom ddosbarthu celloedd fel rhai positif pe bai'r signal immunofluorescence yn cronni ar unrhyw lefel o'r bilen, cytoplasm neu gnewyllyn uwchlaw gwerth 50 wedi'i fesur ar feddalwedd ImageJ gan ddefnyddio gorchymyn trothwy. Cafodd celloedd negyddol eu categoreiddio fel celloedd heb unrhyw imiwn-adweithedd. Dadansoddodd dau ymchwilydd annibynnol y data.
4.6. Dadansoddiad Lled- feintiol
Gwerthuswyd dwyster -tubulin, gwrthdroad a signal staenio DVL-1 gan ddau ymchwilydd annibynnol gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ. Mesurwyd dwyster signal cyffredinol ar ôl gosod y ddelwedd mewn 8-math did; wedi hynny, gwerthuswyd dwyster staenio marciwr yn 20 pct, dct a g trwy fesur arwynebedd amlinellol y strwythur. Os oedd canlyniadau rhwng gwerthuswyr yn wahanol, eglurodd trydydd ymchwilydd annibynnol yr amheuaeth. Dwysedd signal uchaf ar gyfer -tubulin oedd 84.125 ± 3.214 SD, ar gyfer gwrthdroad oedd 71.50 ± 2.715 SD ac ar gyfer DVL-1 80.916 ± 1.875 SD. Marciwyd y dirlawnder uchaf o liw signal ar y ffotograffau microsgop fel 3 (66.66-99.99 y cant o ddwysedd delwedd signal cyffredinol), ac yna 2 (33.33-66.66 y cant) ar gyfer dwyster canolraddol y signal ac 1 (0.33 y cant -33.33 y cant ) ar gyfer dwysedd signal isel (Tabl 1.).
4.7. Dadansoddiad Ystadegol
Er mwyn pennu gwahaniaethau rhwng camau a strwythurau, cynhaliwyd prawf Kruskal-Wallis, ac yna post hoc Dunn gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, UDA, www.graphpad.com (cyrchwyd ar 15 Hydref). 2018.)). Mynegwyd nifer y celloedd positif mewn canran fel gwerth cymedrig ± gwyriad safonol (SD), tra bod arwyddocâd ystadegol yn cael ei gydnabod yn p < 0.05.="" roedd="" nifer="" y="" strwythurau="" a="" ddadansoddwyd="" yn="" 4200="" mewn="" 35="" o="" samplau,="" gyda="" nifer="" cyffredinol="" o="" 135,256="" o="" gelloedd="" wedi'u="" cyfrif.="" fe="" wnaethom="" ddefnyddio="" 2-way="" anova="" gyda="" phrawf="" post="" hoc="" sidak="" i="" brofi="" gwahaniaethau="" mewn="" mynegiant="" -tubulin,="" gwrthdroad="" a="" dvl-1="" mewn="" gwahanol="" gamau="" datblygiadol.="" i="" astudio="" mynegiant="" protein="" yn="" ymwneud="" ag="" amser="" datblygiadol,="" fe="" wnaethom="" ddefnyddio="" atchweliad="" llinol.="" defnyddiwyd="" anova="" un="" ffordd="" ac="" yna="" prawf="" post="" hoc="" tukey="" i="" archwilio'r="" gwahaniaethau="" mewn="" mynegiant="" -tubulin,="" gwrthdroad="" a="" dvl-1="" mewn="">arenmeinwe o'i gymharu â meinweoedd MCDK, FSGS a CNF. Ymchwiliwyd i wahaniaethau mewn mynegiant proteinau rhwng MCDK, FSGS a CNF gyda 2-ffordd ANOVA ac yna prawf post hoc Sidak. Defnyddiwyd ANOVA un ffordd ac yna prawf post hoc Tukey i werthuso'r gwahaniaethau mewn hyd cilia ac uchder celloedd epithelial pct rhwng rheolaeth iach a patholegolarenmeinweoedd. Dangoswyd data fel gwerth cymedrig ± gwyriad safonol (SD) gyda gwahaniaeth ystadegol yn cael ei gydnabod yn p <>
