Mae Atalydd Farnesyltransferase LNK-754 Yn Gwanhau Nychdod Axonal Ac yn Lleihau Patholeg Amyloid mewn Llygod Rhan 1

Haniaethol

Cefndir:

Mae dyddodiad plac amyloid a dirywiad echelinol yn ddigwyddiadau cynnar mewn pathogenesis AD. Mae A yn tarfu ar ficrotiwbwlau mewn niwritau dystroffig presynaptig, gan arwain at groniad o organynnau endolysosomaidd ac awtoffagig â nam sy'n cludo ensym hollti protein rhagflaenydd amyloid safle (BACE1). O ganlyniad, mae niwritau dystroffig yn cynhyrchu A 42 ac yn cyfrannu'n sylweddol at ddyddodiad plac.

Mae dirywiad echelinol yn anhwylder niwrolegol sy'n achosi niwed i acsonau niwronau, gan effeithio ar ddargludiad nerfau. Mae imiwnedd yn llinell amddiffyn bwysig i'r corff dynol i wrthsefyll goresgyniad germau a firysau tramor. Felly, a oes perthynas rhwng dirywiad echelinol ac imiwnedd?

Yn gyntaf, nid yw dirywiad echelinol yn glefyd a achosir gan y system imiwnedd, felly nid oes angen poeni am imiwnedd sy'n effeithio'n negyddol arno. Er nad yw achos penodol dirywiad echelinol yn hysbys, mae rhai astudiaethau'n awgrymu y gallai dirywiad echelinol fod yn gysylltiedig ag ymatebion llidiol yn y system imiwnedd. Mae'r ymateb llidiol yn fecanwaith amddiffynnol y system imiwnedd yn erbyn goresgyniad pathogenau tramor. Fodd bynnag, os caiff ei orfywiogi, bydd yn achosi niwed llidiol i niwronau ac yn hybu dirywiad echelinol.

Yn ail, gall system imiwnedd gref wella ymwrthedd y corff a lleihau'r risg o haint a chlefyd, sy'n arbennig o bwysig i gleifion â dirywiad echelinol. Oherwydd bod system nerfol cleifion â dirywiad echelinol wedi'i niweidio, mae gallu hunan-atgyweirio'r corff yn gymharol wan. Os ydynt yn dioddef o afiechydon eraill, bydd y cyflwr yn gwaethygu ac yn effeithio ymhellach ar ansawdd eu bywyd. Felly, gall cynnal diet iach ac arferion byw a gwella imiwnedd helpu i leihau'r risg o glefydau eraill. Ar yr un pryd, gall wella ymateb imiwn y corff a hyrwyddo atgyweirio acsonau ac adfer dargludiad nerfau.

I grynhoi, er nad oes cysylltiad angenrheidiol rhwng dirywiad echelinol ac imiwnedd, gall system imiwnedd iach ddarparu'r amddiffyniad a'r gefnogaeth angenrheidiol i gleifion â dirywiad echelinol. Felly, dylem dalu sylw i bwysigrwydd cynnal y system imiwnedd, gan ddechrau o agweddau megis diet ac arferion byw, a gwella lefel imiwnedd y corff yn weithredol i osod sylfaen gadarn ar gyfer iechyd a hirhoedledd. Gellir gweld bod angen i ni wella cof, a gall Cistanche deserticola wella cof yn sylweddol oherwydd bod Cistanche deserticola yn ddeunydd meddyginiaethol Tsieineaidd traddodiadol sydd â llawer o effeithiau unigryw, ac un ohonynt yw gwella cof. Daw effeithiolrwydd briwgig o'r gwahanol gynhwysion gweithredol sydd ynddo, gan gynnwys asid, polysacaridau, flavonoidau, ac ati. Gall y cynhwysion hyn hybu iechyd yr ymennydd mewn amrywiaeth o ffyrdd.

Cliciwch gwybod 10 ffordd i wella cof

Mae atalyddion Farnesyltransferase (FTI) wedi cael eu hymchwilio'n ddiweddar i'w hail-leoli tuag at drin anhwylderau niwroddirywiol a rhwystro gweithrediad farnesyltransferase (FTase) i gatalysio farnesylation, addasiad ôl-gyfieithu sy'n rheoleiddio proteinau sy'n ymwneud â swyddogaeth lysosome a sefydlogrwydd microtiwbwl. Mewn ymennydd post mortem AD, mae FTase a'i signalau i lawr yr afon yn cael eu huwchreoleiddio. Fodd bynnag, nid yw effaith FTIs ar batholeg amyloid a niwritau dystroffig yn hysbys.

Dulliau:

Fe wnaethon ni brofi effeithiau'r FTIR LNK-754 a lonafarnib yn y model llygoden 5XFAD o batholeg amyloid.

Canlyniadau:

Mewn 2-mis oed llygod 5XFAD trin yn gronig am 3 mis, LNK-754 lleihau baich plac amyloid, a hyperffosfforyleiddiad tau, a gwanhau'r casgliad o BACE1 a LAMP1 mewn niwritau dystroffig. Mewn 5-mis oed llygod 5XFAD trin yn llym am 3 wythnos, LNK-754 lleihau maint niwrit dystroffig a chrynodiad LysoTracker-Green yn absenoldeb effeithiau ar ddyddodion A. Gwellodd triniaeth acíwt gyda LNK-754 diffygion cof a dysgu mewn llygod amyloid HAPP/PS1.

Mewn cyferbyniad â LNK-754, roedd triniaeth lonafarnib yn llai effeithiol o ran lleihau placiau, hyperffosfforyleiddiad tau, a niwritau dystroffig, a allai fod wedi deillio o lai o nerth yn erbyn FTase o gymharu â LNK-754. Fe wnaethom ymchwilio i effeithiau FTIs ar fasnachu echelinol organynnau endolysosomaidd a chanfod bod lonafarnib a LNK-754 yn gwella trafnidiaeth echelinol ôl-radd mewn niwronau cynradd, gan nodi y gallai FTIs gefnogi aeddfedu endosomau hwyr echelinol yn lysosomau. Ymhellach, cynyddodd triniaeth FTI lefelau LAMP1 mewn niwronau cynradd llygoden ac ymennydd llygod 5XFAD, gan ddangos bod FTIs wedi ysgogi biogenesis organynnau endlysosomaidd.

Casgliadau:

Rydym yn dangos data newydd i awgrymu bod LNK{0}} wedi hybu masnachu axonal a swyddogaeth adrannau endolysosomaidd, yr ydym yn rhagdybio bod llai o nychdod echelinol, llai o groniad BACE1, ac atal dyddodiad amyloid mewn llygod 5XFAD. Mae ein canlyniadau yn cytuno â gwaith blaenorol yn nodi FTase fel targed therapiwtig ar gyfer trin proteinopathïau a gallai fod â goblygiadau therapiwtig pwysig wrth drin AD.

Geiriau allweddol:

Clefyd Alzheimer, niwritau Dystroffig, atalyddion Farnesyltransferase.

Cefndir

Mae clefyd Alzheimer (AD) yn glefyd niwro-ddirywiol cynyddol sy'n achosi dementia mwyaf cyffredin ymhlith y boblogaeth sy'n heneiddio ac fe'i nodweddir gan nam sylweddol mewn dysgu a chof. Ar y lefel foleciwlaidd, nodweddion nodedig yr ymennydd AD yw cronni placiau amyloid- (A ) a phresenoldeb cynhwysiant tau hyperffosfforylaidd.

Yn ystod cyfnodau cynnar, asymptomatig AD, mae A yn cronni yn yr ymennydd am dros ddau ddegawd neu fwy cyn i nam ar y cof ddechrau [1-3]. O ganlyniad, mae lleihau lefelau A yr ymennydd wedi bod yn ffocws canolog i strategaethau triniaeth ar gyfer AD [4]. Ar hyn o bryd, yr unig therapi addasu clefydau a gymeradwyir yn amodol gan yr FDA yw gwrthgorff gwrth-A sy'n clirio ffurfiau cyfun o A o'r ymennydd [5], gan gadarnhau bod targedu A yn yr ymennydd yn ddull addawol o drin AD.

Fodd bynnag, mae'r rhan fwyaf o dreialon clinigol sy'n canolbwyntio ar A wedi methu oherwydd pryderon diogelwch neu effeithiolrwydd, ac mae pwyslais bellach wedi'i roi ar dargedau yn seiliedig ar wahanol ddamcaniaethau AD, gan gynnwys lluosogi tau, llid, dyshomeostasis calsiwm, a ffactorau niwrofasgwlaidd [4, 6, 7 ]. Yn ogystal, mae diddordeb cynyddol ym mhotensial therapiwtig actifadu llwybrau diraddiol lysosomaidd fel dull i leihau proteinau pathogenig, nodwedd sy'n gyffredin ar draws clefydau niwroddirywiol [8-12].

Mae camweithrediad helaeth o lwybrau endolysosomaidd ac awtoffagic wedi'i ddogfennu'n dda fel digwyddiad cynnar o pathogenesis AD. Mae llawer o loci genetig tueddiad AD yn gysylltiedig â chludiant endolysosomaidd isgellog a swyddogaeth lysosome [13], ac mae organynnau endolysosomaidd ac awtoffagaidd camweithredol mwy yn cronni yn yr ymennydd AD o fewn niwritau dystroffig [14, 15].

Mae'n ymddangos bod niwritau dystroffig yn cael eu cychwyn ar anaf niwronaidd, ac yn OC cynigir bod hyn yn ansefydlogi microtiwbiau gan A [16]. Mae hyn yn arwain at chwyddiadau echelinol ffocal sy'n tarfu ar lwybrau masnachu mewn pobl a diraddio arferol proteinau allweddol sy'n gysylltiedig â chynhyrchu A, gan gynnwys BACE1 [16, 17]. O ganlyniad, mae dystroffiau'n cynhyrchu A 42 ac yn cyfrannu'n sylweddol at ddyddodiad plac allgellog a nychdod echelinol [18], gan gychwyn llwybr bwydo ymlaen sy'n arwain at golled synaptig, niwroddirywiad, a diffygion gwybyddol [16].

Gallai strategaethau therapiwtig sy'n gwella cludiant a gweithgaredd organynnau endlysosomaidd ac awtoffagig atal nychdod niwritig rhag cynnal diraddiad proteinau pathogenig, a bod yn fecanwaith hanfodol ar gyfer lleihau lefelau BACE1 ac A mewn AD.

Wrth i'r chwiliad barhau am driniaeth AD effeithiol, mae nifer y cyffuriau a ail-bwrpaswyd mewn treialon clinigol ar gyfer AD wedi cynyddu'n sylweddol gan fod gan gyffuriau a werthuswyd yn glinigol broblemau diogelwch ac effeithiolrwydd hysbys, gan gyflymu'r broses datblygu cyffuriau [7, 19]. Yn y blynyddoedd diwethaf, mae astudiaethau wedi nodi FTIs fel dosbarth o gyffuriau sydd â'r potensial i gael eu hailddefnyddio ar gyfer trin clefydau niwroddirywiol.

Mae FTIs yn atal farnesylation, addasiad ôl-gyfieithu sy'n rheoleiddio proteinau lle mae farnesyl pyrophosphate wedi'i addasu'n cofalent i weddillion cystein mewn proteinau sy'n cynnwys motiff CAAX [20]. Dyluniwyd FTIs i ddechrau i rwystro gweithgaredd Ras oncogenig trwy atal ei brenyleiddiad ond fe'u daethpwyd i ben mewn treialon clinigol ar gyfer triniaeth canser ar ôl darganfod llwybrau prenylation Ras am yn ail [21, 22].

Fodd bynnag, mae llawer o swbstradau FTase yn bodoli [23-25], gan arwain at werthuso FTIs ar gyfer ystod eang o anhwylderau, gan gynnwys clefyd cardiofasgwlaidd, hepatitis D, a progeria [20, 26]. Yn ogystal, mae FTIs wedi dangos addewid tuag at glefydau niwroddirywiol a nodweddir gan groniad o agregau protein. Mewn modelau meithriniad cnofilod a chelloedd o broteinopathïau, mae FTIs yn ysgogi gweithgaredd lysosomaidd a phroteolysis proteinau gwenwynig sy'n benodol i glefydau [8, 9, 27, 28].

Yn flaenorol, dangoswyd bod LNK-754, sef FTI a brofwyd mewn treialon canser, wedi gwella masnachu hydrolase lysosomaidd, ac wedi lleihau agregau alffa-synuclein (-synuclein) mewn niwronau sy'n deillio o gleifion clefyd Parkinson (PD) a modelau llygoden PD [8 ].

Mae astudiaethau eraill wedi nodi canlyniadau tebyg o FTIs tuag at leihau agregau protein; trin modelau diwylliant celloedd o PD gyda FTI-277 -synuclein gostyngol [28] a lonafarnib, FTI a gymeradwywyd gan FDA ar gyfer trin progeria [29], mwy o weithgaredd lysosomaidd a llai o gynhwysiant tau mewn model llygoden o tauopathi [29] 9]. Ar ben hynny, dangosodd astudiaeth ddiweddar fod cnocio genetig o FTase niwronaidd yn y model llygoden APP / PS1 o AD yn atal cenhedlaeth A [30]. Ffocws astudiaethau blaenorol sy'n gwerthuso FTIs ar gyfer proteinopathïau fu rôl swbstradau FTase mewn gweithgaredd lysosom ac awtophagi.

Fodd bynnag, gwyddys hefyd bod FTIs yn hyrwyddo sefydlogrwydd microtiwb (MT) ac yn synergeiddio â chyffuriau sefydlogi MT i wella asetyleiddiad tiwbin, trwy lwybr Ras-annibynnol [31-33]. Mae sefydlogi MT yn atal patholeg AD mewn llygod APP / PS1 [34], ac ar hyn o bryd, mae nifer o asiantau sefydlogi MT yn cael eu hymchwilio'n glinigol ar gyfer trin AD [35]. Felly, mae tystiolaeth sylweddol yn awgrymu y gallai FTIs fod o fudd i glefydau a nodweddir gan fecanweithiau homeostasis protein camweithredol fel AD. Eto i gyd, nid yw'r targedau a'r llwybrau sy'n cysylltu farnesylation protein â llai o agregau protein mewn clefydau niwroddirywiol yn cael eu deall yn llawn.

Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom asesu a all triniaeth ffarmacolegol gyda FTIs wella patholeg AD sy'n gysylltiedig ag A. Fe wnaethom werthuso effeithiau LNK-754 a lonafarnib, dau FTI y gwyddys eu bod yn lleihau agregau protein mewn anhwylderau niwroddirywiol, ar faich plac a niwritau dystroffig ym model llygoden 5XFAD o batholeg amyloid. Mae ein canlyniadau yn rhoi mewnwelediad i'r llwybrau y mae ataliad FTase yn effeithio arnynt ac yn cefnogi'n gryf ymchwiliad pellach i ail-bwrpasu FTIs fel therapiwtig ar gyfer AD a chlefydau niwroddirywiol eraill a nodweddir gan groniad agregu protein.

Defnyddiau a dulliau

Triniaethau anifeiliaid a chyffuriau

Gwnaed yr holl waith anifeiliaid gan gymeradwyaeth Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Prifysgol Gogledd-orllewinol (IACUC). Roedd llygod yn cael eu bwydo â diet cnofilod safonol a dŵr ad libitum ac yn cael eu cadw dan do â chylch arferol o 12-awr golau/tywyll. Roedd llygod 5XFAD ar gefndir C57BL6 (Jackson Laboratories) yn cael eu cynnal trwy groesi llygod hemizygous gwrywaidd trawsgene-positif C57BL6 gyda llygod C57BL6 benywaidd trawsgen-negyddol (Jackson Laboratories).

Yn ein protocol triniaeth gronig, cychwynnwyd triniaethau cyffuriau yn 2 fis oed, yr oedran y mae dyddodiad plac yn dechrau [36, 37]. Yn y protocol triniaeth acíwt, cychwynnwyd triniaeth gyffuriau yn 5 mis oed ac ar ôl hynny mae dyddodiad plac a dirywiad echelinol yn eang [38, 39].

Cafodd LNK{{0}} ei syntheseiddio gan Link Medicine (Massachusetts USA) a chafwyd lonafarnib gan Cayman Chemical Company (Ann Harbour, MI). Ar gyfer triniaethau anifeiliaid, paratowyd LNK-745 a lonafarnib mewn hydoddiant wedi'i gynhesu o 0.5% carboxymethylcellulose (Sigma-Aldrich) fel cerbyd ar grynodiad o 0.10mg/mL nes ei doddi a bod yr ateb wedi'i clir.

Roedd aliquots ar gyfer pigiad yn cael eu rhewi ar −20 gradd ac yna'n cael eu dadmer a'u storio ar 4 gradd am bob wythnos o driniaeth. Cafodd llygod eu trin yn dilyn protocol sefydledig y gwyddys ei fod yn gwella gweithgaredd lysosom [8]. Yn y protocol triniaeth gronig, cafodd llygod 5XFAD mis oed {{3}) eu chwistrellu gan chwistrelliad mewnperitoneol (ip) gyda'r naill gerbyd neu'r llall, LNK754, neu lonafarnib bob dydd gan ddefnyddio chwistrell inswlin 29-am 12 wythnos nes bod llygod yn 5 oed. mis oed. Yn y drefn triniaeth acíwt, roedd 5-llygod 5XFAD mis oed yn cael eu chwistrellu bob dydd am 3 wythnos.

Ar ôl cwblhau'r triniaethau, cafodd llygod eu hanestheteiddio a'u darlifo, a chasglwyd yr ymennydd ar gyfer dadansoddiadau pellach (gweler yr adrannau isod). Ar gyfer arbrofion meithrin celloedd, diddymwyd LNK-754 a lonafarnib mewn DMSO a'u hychwanegu at ddiwylliannau niwronau cynradd llygoden ar grynodiad o 10nM am 48 awr. Roedd triniaeth y cerbyd yn gyfwerth â DMSO. Casglwyd celloedd a'u dadansoddi fel y disgrifir isod.

Gwrthgyrff

Y gwrthgyrff a ddefnyddiwyd ar gyfer arbrofion imiwn-fflworoleuedd oedd llygod mawr gwrth-LAMP1 (# 1D4B, DSHB), cwningen gwrth-A 42 (# 700254, Invitrogen), cwningen gwrth-BACE1 (#ab108394, Abcam), cwningen gwrth-III twbwlin (#ab18207, Abcam). Ar gyfer imiwnoblotio, y gwrthgyrff a ddefnyddiwyd oedd gwrth-actin cwningen (#926–42,210, LI-COR), antip44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), gwrth-cwningen-44/42 (Erk1/2) (#CS137F5, Technoleg Signalau Cell), gwrth-LAMP1 cwningen (#CS3234, Technoleg Signalau Cell), gwrth-BACE llygoden (3D5; Zhao et al., 2007), gwrth-APP llygoden (6E10) ( #803001, BioLegend), gwrth-p-tau cwningen (ser404) (#CS20194, Technoleg Signalau Cell), llygoden gwrth-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), prelamin-A, (#MABPT858, Millipore Sigma) a gwrth-lygoden -HDJ-2 (#sc-59,554, Santa Cruz). Defnyddiwyd gwrthgyrff eilaidd gwrth-gwningen neu -lygoden o Labordai Vector ar gyfer imiwnoblotiau.

Profi ymddygiad

Trin anifeiliaid a chyffuriau

Perfformiwyd dadansoddiadau ymddygiadol gan reMYND, Inc. gan ddefnyddio model llygoden HAPP/PS1 gyda mynegiant niwron-benodol o mutant clinigol o'r protein rhagflaenydd amyloid dynol ynghyd â mutant clinigol o presenilin dynol 1 [40]. Mae'r llygoden drawsgenig ddwbl hon yn dangos y croniad digymell, cynyddol o A yn yr ymennydd, gan arwain yn y pen draw at blaciau amyloid yn yr subiculum, hippocampus, a cortecs yn 6 mis oed. Defnyddiwyd 48 o lygod HAPP/PS1 benywaidd mewn cefndir FVB x C57Bl/6J o 6 mis oed ar gyfer yr astudiaeth hon, ar y cyd â 12 rheolydd math gwyllt benywaidd sy’n cyfateb i oedran yng nghefndir FVB x C57Bl/6J. Gweinyddwyd 0.9mg/kg/diwrnod o LNK-754 fesul mesurydd llafar, unwaith y dydd, am 12 diwrnod yn olynol. Perfformiwyd aberth yr anifeiliaid 2 awr ar ôl y dos terfynol.

Cafodd yr holl lygod eu genoteipio gan adwaith cadwynol polymeras (PCR) yn 3 wythnos oed a chawsant rif adnabod unigryw, unwaith roedd y canlyniadau PCR yn hysbys. Roedd pob llygod yn cael eu gwirio ddwywaith gan ail PCR cyn i'r astudiaeth ddechrau. Roedd pob llygoden yn ddall ar hap ac yn cyfateb i'w hoedran. Rhoddwyd rhif ar hap i lygod gan gyfrifiadur a'i ddyrannu ar hap i driniaeth. Cafodd yr anifeiliaid eu hail-gawell gan y grŵp trin 15 diwrnod cyn i'r astudiaeth ddechrau er mwyn eu galluogi i ymgyfarwyddo â'r cyd-destun cawell newydd. Roedd gan lygod fynediad am ddim i ddŵr di-haint wedi'i hidlo ymlaen llaw a chow llygoden safonol (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, yr Almaen). Roedd y bwyd yn cael ei storio dan amodau sych ac oer mewn ystafell storio wedi'i hawyru'n dda. Roedd faint o ddŵr a bwyd yn cael ei wirio bob dydd, yn cael ei gyflenwi yn ôl yr angen ac yn cael ei adnewyddu unwaith yr wythnos. I ddechrau, roedd llygod yn cael eu cadw dan rythm dydd-nos wedi'i wrthdroi (14 awr o olau / 10 awr o dywyllwch) gan ddechrau am 7 pm mewn cewyll metel safonol o'r math RVS T2 (arwynebedd o 540 cm2 ).

Mae'r cewyll yn cynnwys lloriau solet a haenau o wasarn gwely. Cyfyngwyd nifer y llygod fesul cawell gan ddeddfwriaeth leol ar les anifeiliaid. 15 diwrnod cyn dechrau'r driniaeth, cafodd llygod eu hail-gawellu mewn cewyll macrolon T2 wedi'u hawyru'n unigol a'u cludo i'r labordy i'w haddasu i amgylchedd y labordy i baratoi ar gyfer triniaeth. Yn y labordy, newidiwyd y rhythm dydd-nos i 12 awr o olau / 12 awr o dywyllwch, gan ddechrau am 7 pm

drysfa ddŵr Morris

Perfformiwyd y Morris Water Maze ar ddiwrnodau 8-12 o driniaeth, ac aberthwyd yr anifeiliaid yn syth ar ôl y prawf archwilio. Roedd y pwll (llestr gwyn, crwn 1m mewn diamedr) yn cynnwys dŵr ar 20 gradd gyda thitaniwm deuocsid fel ychwanegyn di-arogl, diwenwyn i guddio'r llwyfan dianc (1cm o dan lefel y dŵr). Cafodd nofio pob llygoden ei recordio a'i ddadansoddi (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, yr Iseldiroedd). Cyn hyfforddi, gosodwyd pob llygoden ar ben y platfform am 15 eiliad. Ar gyfer profion llywio lle, hyfforddwyd llygod i leoli'r platfform cudd mewn saith bloc o dri threial dros bedwar diwrnod yn olynol.

Mae pob treial yn cynnwys prawf nofio gorfodol o uchafswm o 120 eiliad, ac yna 10 munud o orffwys. Mesurwyd yr amser yr oedd ei angen ar bob llygoden i leoli'r platfform. Mae'r saith bloc yn olynol yn arwain at gromlin ddysgu. 24 awr ar ôl yr hyfforddiant diwethaf, cafodd pob anifail brawf stiliwr gan dynnu'r platfform. Caniatawyd i lygod chwilio am 60 eiliad, a mesurwyd amser chwilio cwadrant a chroesfannau safle gwreiddiol y platfform. Yn ystod y prawf archwilio terfynol, caniatawyd i lygod chwilio lleoliad blaenorol y platfform am 60 eiliad ar ôl tynnu'r platfform.

Diwylliant niwronau cynradd

Rhannwyd blaenebrain yn hydoddiant Halen Cytbwys Hanks (HBSS) (Thermo Fisher #14185-052) o lygod C57BL6 tebyg i wyllt (Jackson) ar E15.5 i gael niwronau cynradd. Treuliwyd blaenebion dyranedig mewn trypsin 2.5% ar 37 gradd am 20 munud. Defnyddiwyd pibed Pasteur wedi'i sgleinio â thân i ddatgysylltu'r niwronau yn HBSS. Yna cafodd y niwronau eu platio ar blât chwe ffynnon poly-L-lysin, 2 × 106 niwronau fesul ffynnon mewn cyfrwng niwro-basal wedi'i ategu â 2% B-27, 500μM glutamine, serwm ceffyl 10%, a 2.5μM glwtamad (i gyd gan Thermo Fisher).

Newidiwyd y cyfryngau 2 awr yn ddiweddarach i Neurobasal gyda 2% B-27, 500μM glutamine, a 2.5μM glwtamad. 24 awr yn ddiweddarach, newidiwyd y cyfryngau i Neurobasal ynghyd â 2% B-27 a 500μM glutamine. Gwnaed hanner newidiadau cyfryngau bob 2-3 diwrnod. Cafodd niwronau cynradd eu meithrin am 7 diwrnod a'u trin â chrynodiadau cerbyd (DMSO) neu 10nM o LNK-754, neu lonafarnib am 48 awr. Yna cafodd niwronau eu gosod neu eu delweddu'n fyw fel y disgrifir isod.

Ar gyfer sefydlogi, cafodd niwronau eu deor am 20 munud mewn 4% paraformaldehyd, 0.12M swcros mewn 1XPBS, athraidd yn 0.5% Triton X-100, a'u deor â gwrthgyrff cynradd dros nos ac yna asyn gwrth-lygoden gwrthgyrff eilaidd cyfun Alexafuor (Molecular Probes, 1:1000) ac wedi'u cyd-staenio â 300nM DAPI. Gosodwyd slipiau clawr gan ddefnyddio Prolong Gold (Molecular Probes), a chaffaelwyd delweddau ar ficrosgop confocal Nikon A1 gydag amcan 60X (NA 1.4) a meddalwedd NIS Elements.

Delwedd fyw o niwronau

Ar gyfer arbrofion delweddu byw, paratowyd niwronau fel uchod a'u platio mewn dysglau gwaelod gwydr 35mm (MatTek # P35G-1.{4}}C) am 7 diwrnod mewn diwylliant. Yna ychwanegwyd 10nM LNK-754 neu lonafarnib at gyfryngau cyflyredig, cafodd diwylliannau rheoli eu trin â DMSO fel cerbyd. Ar ôl 48 awr o driniaeth, disodlwyd y cyfryngau gan gyfryngau cyflyru o blatiau cyfochrog o niwronau heb eu trin. Ychwanegwyd 25nM o LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) at y cyfryngau cyflyru, a deorwyd niwronau am 30 munud ar 37 gradd .

Perfformiwyd delweddu treigl amser o niwronau gan ddefnyddio microsgop maes llydan Ti2. Dechreuodd delweddu ar unwaith ar ôl 30 munud a pharhaodd am ddim mwy na 30 munud. Cymerwyd datguddiadau 1- bob munud, a lluniwyd 20-30 o ardaloedd ar wahân fesul pryd o fewn 30 munud. Perfformiwyd mesuriadau pellter a chyflymder gronynnau LysoTracker a dadansoddiadau kymograph gan ddefnyddio meddalwedd NIS Elements a disgrifir yn fanwl isod. Mewn arbrofion ar wahân, ychwanegwyd 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) at gyfryngau cyflyredig, a chymerwyd delweddau wedi'u dal o niwronau byw am ddim mwy na 15 munud gan ddefnyddio microsgop confocal Nikon A1 gydag amcan 60X (NA 1.4) a meddalwedd NIS Elements.

For more information:1950477648nn@gmail.com