Mae Glwcos yn Cael Effaith Gwrth-Melanogenig Trwy Anactifadu Tyrosinase yn Anuniongyrchol mewn Melanocytes A Chyfwerth â Chroen Dynol

Crynodeb:

Mae siwgrau yn hollbresennol mewn organebau ac yn gynhwysion cosmetig adnabyddus ar gyfer lleithio croen heb fawr o sgîl-effeithiau. Mae glwcos, siwgr syml a ddefnyddir fel ffynhonnell ynni gan gelloedd byw, yn cael ei ddefnyddio'n aml mewn cynhyrchion gofal croen. Mae sawl adroddiad wedi dangos bod siwgr a chyfansoddion sy'n gysylltiedig â siwgr yn cael effeithiau gwrth-melanogenig ar felanocytes. Fodd bynnag, nid yw'r mecanwaith moleciwlaidd sylfaenol y mae glwcos yn ei ddefnyddio i atal synthesis melanin yn hysbys, er bod glwcos yn cael ei ddefnyddio fel cynhwysyn gwynnu yn ogystal â chynhwysyn lleithio mewn colur. Yma, canfuom fod glwcos yn lleihau'n sylweddol y cynnwys melanin mewn celloedd B16 a symbylir gan hormonau -melanocyte (MSH) a melanocytau dynol normal â phigmentau tywyll heb unrhyw arwyddion o sytowenwyndra.

Ar ben hynny, dangosodd triniaeth amserol o glwcos ei effeithiolrwydd gwynnu trwy ffotograffiaeth, staenio Fontana-Masson (F&M), a microsgopeg aml-ffoton mewn model croen dynol pigment 3D, MelanoDerm. Fodd bynnag, nid oedd glwcos yn newid mynegiant genynnau na lefelau protein proteinau melanogenig mawr mewn melanocytes. Er bod glwcos wedi lleihau gweithgaredd tyrosinase mewngellol yn sylweddol mewn melanocytes, nid oedd yn lleihau gweithgaredd tyrosinase madarch mewn system arbrofol di-gell. Fodd bynnag, cafodd glwcos ei fetaboli i asid lactig, a all atal gweithgaredd tyrosinase yn bwerus. Felly, daethom i'r casgliad bod glwcos yn atal gweithgaredd tyrosinase yn anuniongyrchol trwy drawsnewid yn asid lactig, gan esbonio ei effeithiau gwrth-melanogenig mewn melanocytes.

Mae tyrosinase gwynnu yn ensym allweddol yn y synthesis o melanin. Gall cyfanswm glycosidau Cistanche deserticola - cyfansoddyn sydd wedi'i ynysu o feddyginiaeth lysieuol Tsieineaidd naturiol Cistanche deserticola is-reoleiddio gweithgaredd tyrosinase yn sylweddol. Mae'r effaith yn ataliad cildroadwy cystadleuol, a all atal Pigmentation croen yn effeithiol, effaith harddwch gwynnu gwych. Dangosodd y data arbrofol: pan oedd crynodiad cyfanswm glycosidau Cistanche deserticola yn yr ystod 0.5-3.0 mg·mL-1, roedd ganddo atalydd effaith ar actifedd tyrosinase, a darganfuwyd perthynas dda rhwng dos-effaith yn yr ystod o 0.5-2.0 mg·mL-1.

Cliciwch i wybod beth yw cistanche

Geiriau allweddol:

melanogenesis; siwgr; glwcos; tyrosinase; cyfatebol croen dynol

1. Rhagymadrodd

Melanogenesis yw'r broses o gynhyrchu melanin ac mae'n hanfodol ar gyfer amddiffyn y croen. Mae melanin yn amsugno golau uwchfioled (UV) ac yn amddiffyn y croen rhag effeithiau niweidiol golau UV a radicalau rhydd [1]. Fodd bynnag, oherwydd bod cynhyrchu melanin yn ormodol yn achosi hyperbigmentation fel brychni haul a lentigo, y gellir ei ystyried yn anesthetig, mae llawer o ymchwil wedi'i neilltuo i ddod o hyd i gynhwysion dad-bigmentaidd effeithiol ar gyfer colur neu feddyginiaeth [2-4].

Mae siwgr yn humectant pwerus ar gyfer lleithio croen ac fe'i defnyddir fel cynhwysyn cosmetig ar gyfer lleithio croen heb fawr o sgîl-effeithiau. Yn ogystal, mae siwgrau ac asiantau sy'n gysylltiedig â siwgr yn effeithio ar melanogenesis [5,6]. Gellir newid glycosyleiddiad tyrosinase, ensym allweddol sy'n ymwneud â synthesis melanin, gan atal ei weithgaredd catalytig a chyflymu ei ddiraddiad [7]. Mae rôl siwgrau mewn melanogenesis wedi'i amlygu gan astudiaethau sy'n ymchwilio i effaith glycosylation ar ffenoteip pigmentiad melanocytes a rolau gweddillion siwgr ar weithgaredd catalytig tyrosinase [5-7]. Mae rhai astudiaethau wedi nodi y gall deilliadau siwgr atal aeddfedu tyrosinase, gan effeithio ar ei glycosylation. Er enghraifft, mae N-acetylglucosamine (NAG), hecsos amino a gynhyrchir yn ffisiolegol trwy ychwanegu grŵp amino at glwcos, yn tarfu ar glycosylation tyrosinase, gan arwain at effeithiau dad-bigmentu mewn croen mochyn cwta a chroen dynol [8].

Yn ogystal, mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod cyfansoddion sy'n gysylltiedig â siwgr yn atal mynegiant neu actifadu tyrosinase yn ogystal â newid ei glycosyliad. Er enghraifft, gwnaethom werthuso effeithiolrwydd gwynnu asid galacturonig (GA), asid siwgr sy'n ffurf ocsidiedig o galactos a phrif gydran pectin. Mae asid galacturonig yn cael effaith gwynnu trwy reoleiddio gweithgaredd a mynegiant tyrosinase mewn celloedd melanoma murine B16 a chyfwerth croen dynol [9]. Mewn adroddiad arall, dangosodd math newydd o oligosacarid cylchol, a elwir yn nitrosyl nigerose cylchol (CNN), effaith ataliol uniongyrchol wan ond arwyddocaol ar weithgaredd enzymatig tyrosinase, gan awgrymu un mecanwaith posibl o hypopigmentation [10]. Yn debyg i aeddfedu tyrosinase trwy glycosyliad priodol, gallai mynegiant neu weithgaredd CNN fod yn darged o asiantau gwrth-melanogenig [11]. Fodd bynnag, mae gan asiantau gwrth-melanogenig niferus sgîl-effeithiau difrifol, megis fitiligo [12,13]. Mae diddordeb mawr felly mewn cyfansoddion dad-bigmentaidd mwy diogel.

Yma, fe wnaethom ymchwilio i effeithiau gwrth-melanogenig glwcos ar gelloedd melanoma murine B16 a melanocytes dynol arferol. Yn ogystal, archwiliwyd lliw meinwe a statws epidermaidd gan ddefnyddio staen adran meinwe o groen dynol cyfatebol. Yn seiliedig ar ein canfyddiadau, rydym yn cynnig bod effaith gwynnu glwcos yn dibynnu ar gynhyrchu asid lactig, gan arwain at anactifadu tyrosinase.

2. Canlyniadau

2.1. Effeithlonrwydd Gwrth-Melanogenig Glwcos mewn B16 ac NHMs

Er mwyn ymchwilio i effaith gwrth-melanogenig glwcos, fe wnaethom ddefnyddio dau fath o felanocytes, celloedd melanoma B16 (llinell gelloedd melanoma murine) a melanocytes dynol arferol (NHMs). Yn gyntaf, fe wnaethom benderfynu a oedd glwcos yn wenwynig i gelloedd B16. Ni ddangosodd glwcos unrhyw sytowenwyndra mewn crynodiadau hyd at 100 mM mewn celloedd B16, fel y dangosir yn Ffigur 1A. Yn seiliedig ar y data cytotoxicity, cafodd celloedd B16 eu trin â chrynodiadau amrywiol o glwcos am 72 h ym mhresenoldeb yr hormon ysgogol -melanocyte (MSH), ysgogydd melanogenesis. Fel y dangosir yn Ffigur 1B, roedd glwcos yn rheoleiddio'r cynnwys melanin mewngellol yn glir ac yn sylweddol mewn modd sy'n dibynnu ar ddos. Defnyddiwyd asid Kojic (KA) fel cyfansawdd cyfeirio ar gyfer gwrth-melanogenesis oherwydd fe'i defnyddir yn aml fel cynhwysyn cosmetig sy'n ysgafnhau'r croen [1,3,4]. Roedd lliw lysates mewn celloedd sy'n cael eu trin â glwcos yn ysgafnach na lliw celloedd rheoli (Ffigur 1C).

Yn ogystal, gwnaethom gadarnhau bod swm y melanin sy'n cael ei gyfrinachu i'r cyfryngau diwylliant wedi lleihau a bod lliw'r cyfryngau wedi'i fywiogi (Ffigur 1D). Nesaf, gwnaethom ymchwilio i effaith gwrth-melanogenig glwcos ar NHMs â phigmentau tywyll. Nid oedd glwcos mewn crynodiadau hyd at 100 mM yn sytotocsig am hyd at bedwar diwrnod 4 (Ffigur 1E). Pan benderfynwyd cynnwys melanin ar ôl triniaeth glwcos o NHMs am 4 diwrnod, canfuom fod cynnwys melanin yn gostwng mewn modd dos-ddibynnol (Ffigur 1F). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod glwcos yn atal synthesis melanin mewn melanocytes.

Ffigur 1. Effaith glwcos ar gelloedd B16 a melanocytes dynol arferol (NHMs). (A) Effaith glwcos ar hyfywedd celloedd B16. (B) Cynnwys melanin mewngellol mewn celloedd B16 a symbylir gan MSH. Penderfynwyd ar gynnwys melanin mewngellol gan ddefnyddio lysates cell, fel y disgrifir yn yr adran dulliau. (C) Lliw lysate cell. (D) Penderfynwyd ar gynnwys melanin allgellog gan ddefnyddio cyfryngau diwylliedig sy'n cynnwys melanin wedi'i secretu ar ôl cyd-driniaeth glwcos a -MSH am 72 h. Mae KA yn dynodi asid kojic (100 µg/mL), a ddefnyddiwyd fel cyfansoddyn cyfeirio. Mae'r llun yn dangos lliwiau cyfryngau diwylliannol. (H) Effaith glwcos ar hyfywedd NHMs. (F) Effeithiau glwcos ar synthesis melanin mewn NHMs. Cafodd NHMs eu trin â'r crynodiadau a nodwyd o glwcos ar gyfer 4 d, eu golchi, a'u gorchuddio â NaOH i bennu'r cynnwys melanin mewngellol. Amcangyfrifwyd y cynnwys melanin yn ôl amsugnedd yn 405 nm a'i normaleiddio gan gyfanswm y cynnwys protein. Mynegir data fel y cymedr ± SD o dri mesuriad annibynnol o leiaf (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

2.2. Gwynnu Effaith Glwcos ar Gyfwerth 3D Croen Dynol

Er mwyn diffinio ymhellach allu gwrth-melanogenig glwcos, defnyddiwyd model croen dynol pigment 3D, MelanoDerm. Fel y disgrifir yn yr adran Deunyddiau a Dulliau, cafodd glwcos ei gymhwyso'n topig i'r MelanoDerm am 18 diwrnod, a phenderfynwyd hyfywedd celloedd gan assay CCK-8. Fel y dangosir yn Ffigur 2A, ni welwyd unrhyw sytowenwyndra meinwe ar ôl triniaeth glwcos am 18 diwrnod. Aseswyd newidiadau lliw meinwe gan ffotograffiaeth. Fel y dangosir yn Ffigur 2B, roedd lliw meinwe a gafodd ei drin â glwcos yn ysgafnach na meinwe wedi'i drin â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS). Yn ogystal, datgelodd staenio hematocsilin ac eosin (H&E) nad oedd glwcos yn achosi cwymp meinwe, tra bod staenio fontana-masson (F&M) yn dangos bod glwcos yn lleihau nifer y melanocytes hyperpigmented (fel y nodir gan saethau) yn yr haen waelodol (Ffigur 2C) .

Er mwyn ymchwilio ymhellach i newidiadau mewn cynnwys melanin, gwnaethom gymharu signalau fflworoleuedd auto melanin yn haenau melanocyte meinweoedd sy'n cael eu trin â PBS a glwcos gan ddefnyddio microsgopeg fflworoleuedd cyffro dau ffoton (TPEF), fel y dangosir yn Ffigur 2D. Dangosodd dadansoddiad o'r delweddau hyn fod y cyfaint melanin wedi gostwng tua 36 y cant a gostyngodd dwyster signal TPEF ar gyfer melanin yn yr ardal gyfoethog melanocyte tua 38 y cant mewn meinweoedd sy'n cael eu trin â glwcos o gymharu â meinweoedd a driniwyd gan PBS.

Ffigur 2. Effaith glwcos ar groen dynol cyfatebol, MelanoDerm. (A) Hyfywedd cyfwerth â chroen dynol sy'n cael ei drin â glwcos. (B) Cafodd cyfwerth â chroen dynol (MelanoDerm; n=3) eu trin yn dopig â glwcos am 18 d, ac yna tynnwyd llun ohonynt. Mae'r gwerth ∆L yn dangos graddau'r ysgafnder o'i gymharu â meinwe sy'n cael ei drin gan PBS. (C) H&E a F&M staenio darnau meinwe. Cafodd y sleidiau eu gosod mewn hydoddiant fformaldehyd a'u mewnosod mewn cwyr paraffin i'w staenio (bar graddfa, 5{{{0}} µm). Mae saethau du yn dynodi melanocytes pigmentog. (D) Perfformiwyd delweddu melanin (200 × 200 × 60 µm3 ) o gyfwerth â chroen dynol gan ddefnyddio microsgopeg TPEF. Mae signalau ffug-liw (coch) yn dynodi melanin (bar graddfa, 50 µm). Mae'r graffiau'n dangos meintioliad cyfaint melanin a signalau TPEF. Mynegir data fel y cymedr ± SD o dri mesuriad annibynnol o leiaf (*p < 0.05, ***p < 0.001).

2.3. Effaith Glwcos ar Fynegiant Proteinau Melanogenig mewn Melanocytes

Nesaf, i egluro'r mecanwaith depigmentation o glwcos mewn melanocytes, rydym yn asesu ei effaith ar fynegiant o ensymau melanogenig megis tyrosinase a Tyrp-1 mewn celloedd B16 a NHMs. Cafodd celloedd B16 eu trin â glwcos am yr amseroedd a nodwyd ym mhresenoldeb -MSH. Yna, penderfynwyd lefelau protein tyrosinase a Tyrp-1 gan assay blotiau Gorllewinol (Ffigur 3A). Ni chafodd lefelau mynegiant tyrosinase a Tyrp-1 eu gostwng gan glwcos ar unrhyw adeg. At hynny, ni effeithiwyd ar lefelau trawsgrifiad tyrosinase gan glwcos mewn celloedd B16 a symbylwyd gan MSH (Ffigur 3B). Yn debyg i gelloedd B16, ni chafodd lefelau protein tyrosinase, Tyrp-1, a MITF eu rhwystro gan glwcos (Ffigur 3C) mewn celloedd NHM a gafodd eu trin â glwcos, ac nid oedd lefelau mRNA o tyrosinase a Tyrp{-1 chwaith. gostwng, ond yn hytrach cynyddu ychydig gan glwcos (Ffigur 3D).

Ffigur 3. Effaith glwcos ar fynegiant proteinau melanogenig mewn celloedd B16 ac NHMs. (A, B) Cafodd celloedd B16 eu trin â -MSH am yr amser a nodwyd ym mhresenoldeb neu absenoldeb glwcos 20 mM. Yna, cynhaliwyd profion Western blot (A) a qRT-PCR (B). (C) Cafodd NHMs eu trin â'r crynodiadau a nodwyd o glwcos am 48 h. Yna, perfformiwyd assay blot y Gorllewin. (D) Cafodd NHMs eu trin â'r amser a nodwyd ym mhresenoldeb glwcos 50 mM. Yna, cynhaliwyd profion qRT-PCR. Mynegir data fel cymedr ± SD o leiaf dri mesuriad annibynnol.

2.4. Effaith Glwcos ar Weithgaredd Tyrosinase

Er mwyn diffinio mecanwaith gweithredu glwcos ymhellach, gwnaethom brofi a oedd yn cael effaith ataliol ar weithgaredd tyrosinase madarch. Fel y dangosir yn Ffigur 4A, canfuom nad oedd gan glwcos unrhyw effaith ataliol ar weithgaredd tyrosinase madarch, sy'n nodi nad yw glwcos yn effeithio'n uniongyrchol ar weithgaredd tyrosinase. Y tro nesaf fe wnaethom berfformio cyfanswm assay gweithgaredd tyrosinase mewngellol gan ddefnyddio lysates celloedd wedi'u trin â glwcos o gelloedd B16 a NHMs. Yn ddiddorol, cafodd gweithgaredd tyrosinase mewngellol ei atal mewn modd dibynnol ar ddos ​​mewn celloedd B16 a driniwyd gan glwcos ym mhresenoldeb -MSH (Ffigur 4B). Mewn NHMs, roedd glwcos hefyd yn atal gweithgaredd tyrosinase mewngellol (Ffigur 4C). Mae'r data hyn yn cefnogi'r posibilrwydd bod glwcos yn anactifadu tyrosinase yn anuniongyrchol mewn melanocytes.

Ffigur 4. Effaith glwcos ar y gweithgaredd tyrosinase. (A) Effaith glwcos ar actifedd tyrosinase madarch mewn system ddi-gell. (B, C) Assay gweithgaredd tyrosinase cellog. (B) celloedd B16 eu trin gyda'r crynodiadau a nodir o glwcos am 24 h. Yna, perfformiwyd assay gweithgaredd tyrosinase cellog, fel y disgrifir yn yr adran dulliau. (C) Cafodd NHMs eu trin â 50 mM o glwcos am yr amser a nodwyd. Yna, perfformiwyd assay gweithgaredd tyrosinase cellog, fel y disgrifir yn yr adran dulliau. Cafodd y gweithgaredd tyrosinase cellog ei normaleiddio gan gyfanswm y cynnwys protein. Mynegir data fel y cymedr ± SD o dri mesuriad annibynnol o leiaf (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

2.5. Anactifadu Tyrosinase trwy Gynhyrchu Asid Lactig mewn Melanocytes wedi'u Trin â Glwcos

Mae glwcos yn cael ei drawsnewid yn lactad metabolyn cellog, sef yr asid lactig mewn hydoddiant ac yr adroddwyd ei fod yn effeithiol wrth drin briwiau pigmentaidd [14,15]. Felly, gwnaethom ragdybio bod glwcos yn cael ei drawsnewid yn asid lactig mewn melanocytes a bod lefelau uwch o asid lactig yn atal melanogenesis trwy anactifadu tyrosinase. I werthuso'r ddamcaniaeth hon, aseswyd yn gyntaf gynhyrchu asid lactig mewn cyfryngau o felanocytes a drinnir â glwcos. Yn ôl y disgwyl, uwch-reoleiddiwyd y cynnwys asid lactig mewn cyfryngau meithrin celloedd B16 yn sylweddol (Ffigur 5A). Yn ogystal, oherwydd gwyddys bod asid lactig yn atal gweithgaredd tyrosinase yn uniongyrchol [15], fe wnaethom werthuso a oedd asid lactig yn atal gweithgaredd tyrosinase madarch. Fel y dangosir yn Ffigur 5B, roedd asid lactig yn atal gweithgaredd tyrosinase madarch yn ddramatig, yn wahanol i glwcos. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod trosi glwcos i asid lactig yn cael effaith gwrth-melanogenig trwy anactifadu tyrosinase gan yr asid lactig.

Ffigur 5. Cynhyrchu lactad gan glwcos ac effaith asid lactig ar y gweithgaredd tyrosinase. (A) Cynhyrchu lactad mewn celloedd B16 sy'n cael eu trin â glwcos. (A) Cafodd celloedd B16 eu trin â'r crynodiadau a nodwyd o glwcos am 3 d. Yna, perfformiwyd assay lactad gan ddefnyddio'r cyfryngau diwylliedig, fel y disgrifir yn yr adran dulliau. (B) Effaith asid lactig ar actifedd tyrosinase madarch mewn system ddi-gell. Mynegir data fel cymedr ± SD o leiaf dri mesuriad annibynnol (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001) .

3. Trafodaeth

Defnyddir siwgrau neu ddeunyddiau sy'n deillio o siwgr yn aml fel cynhwysion cosmetig ar gyfer amddiffyn y croen a rheolaeth ffisiolegol. Er enghraifft, mae raffinose yn cynyddu autophagy mTOR-annibynnol ac yn lleihau marwolaeth celloedd mewn keratinocytes arbelydredig UVB, gan nodi bod gan yr asiant naturiol raffinose werth posibl wrth gyfyngu ar ddifrod ffoto [16]. Mae trehalose a swcros yn ysgogwyr awtoffagy newydd mewn keratinocytes dynol trwy lwybr mTOR-annibynnol [17]. Mae'r canfyddiadau hyn yn rhoi mewnwelediad newydd i reoleiddio awtoffagi mewn ceratinocytes trwy gyfrwng siwgr. Yn achos glwcos, dangoswyd bod glwcos argroenol yn cymell mynegiant claudin-1 a ffilagrin mewn model llygoden o ddermatitis atopig a diwylliant keratinocyte, gan nodi bod ganddo effaith gwrthlidiol trwy atgyweirio swyddogaeth rhwystr croen [18]. Yn ogystal, mae glwcos yn atal amlhau ac yn gwella gwahaniaethu keratinocytes croen [19]. Felly, mae glwcos yn rheoleiddio gwahanol agweddau ar ffisioleg epidermaidd, megis swyddogaethau rhwystr croen a lefelau hydradiad keratinocyte.

Gall siwgrau weithredu fel cyfryngau depigmentary trwy nifer o wahanol fecanweithiau sy'n cynnwys tyrosinase. Er enghraifft, mae rhai asiantau yn atal aeddfedu tyrosinase, tra bod asiantau eraill yn ysgogi ataliad mynegiant neu weithgaredd genynnau tyrosinase [5,8-10]. Fodd bynnag, ychydig o astudiaethau sydd wedi ymchwilio i'r mecanweithiau sy'n sail i effeithiau dibigmentu glwcos.

Er mwyn pennu effaith glwcos ar melanogenesis, buom yn canolbwyntio'n flaenorol ar dderbynyddion X yr afu (LXRs), sef derbynyddion niwclear wedi'u hysgogi gan ligand sy'n chwarae rhan ganolog ym metabolaeth lipid a homeostasis colesterol [20]. Canfuom fod actifadu derbynnydd X yr afu yn atal melanogenesis trwy gyflymu diraddiad ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microphthalmia-gyfryngol (MITF) kinase allgellog (ERK) [21].

Ar ben hynny, mae glwcos yn ligand LXR mewndarddol [22]. Felly, gwnaethom ragdybio bod gan glwcos effeithiau gwrth-melanogenig oherwydd actifadu llwybr dibynnol LXR. Fodd bynnag, fel y dangosir yn Ffigur 3C, ni newidiodd glwcos lefelau mynegiant tyrosinase neu MITF, er bod actifadu LXR wedi lleihau lefelau mynegiant y proteinau hyn mewn melanocytes. Felly, daethom i'r casgliad bod glwcos yn cael effeithiau dadbigmentu ar felanocytes yn annibynnol ar actifadu LXR.

Glwcos yw'r prif swbstrad ar gyfer cynhyrchu ynni, ac mae'n cael ei hydrolysu trwy adweithiau cyfresol o nifer o ensymau, a elwir yn glycolysis. Mae nifer o astudiaethau wedi dangos mai dim ond un cynnyrch terfynol sydd gan glycolysis, sef asid lactig, boed o dan amodau aerobig neu anaerobig. O dan amodau aerobig (O2), defnyddir lactad fel swbstrad lactad dehydrogenase mitocondriaidd (MLD). Mae LDHs yn ei drawsnewid yn pyruvate sy'n mynd i mewn i'r cylch asid tricarboxylic (TCA). O dan amodau anaerobig (N2), mae lactad yn cronni yn y cytosol. Felly, mae'r llwybr glycolysis yn dechrau gyda glwcos fel ei swbstrad ac yn dod i ben gyda chynhyrchu lactad fel ei brif gynnyrch terfynol [23]. Yn ogystal, mae David et al. mesurodd y ffracsiwn o glwcos a droswyd i asid lactig neu pyruvate yn y melanocyte dynol arferol [24]. Roedd y rhan fwyaf o fetabolion glwcos yn asid lactig yn hytrach na pyruvate.

Mae asid lactig yn asid alffa hydroxy (AHA); defnyddir yr asidau hyn yn helaeth mewn fformwleiddiadau cosmetig fel asiantau plicio arwynebol [25]. Yn ogystal, mae asid lactig yn atal ffurfio melanin trwy atal gweithgaredd tyrosinase yn uniongyrchol, effaith sy'n annibynnol ar ei natur asidig, sy'n golygu bod effeithiau asid lactig ar friwiau pigmentaidd nid yn unig oherwydd cyflymiad trosiant celloedd epidermaidd ond hefyd ataliad uniongyrchol o ffurfio melanin mewn melanocytes [15]. Felly, gwnaethom resymu y gallai glwcos gael ei effaith gwrth-melanogenig trwy gynhyrchu asid lactig oherwydd gellir trosi glwcos yn asid lactig.

Yn ôl y disgwyl, canfuom fod triniaeth glwcos yn arwain at gynhyrchu asid lactig mewn melanocytes (Ffigur 5A). Yn ogystal, gwnaethom gadarnhau bod asid lactig yn atal gweithgaredd tyrosinase yn bwerus ac yn uniongyrchol (Ffigur 5B). Roedd Usuki et al. hefyd wedi darganfod bod asid lactig yn lleihau gweithgaredd tyrosinase mewngellol mewn celloedd B16 a chelloedd HM3KO dynol [15]. Yn yr adroddiad, nid oedd asid lactig yn effeithio ar lefelau mRNA a phrotein tyrosinase a Tyrp-1. Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos bod glwcos yn cynyddu cynhyrchiant asid lactig a bod yr asid lactig hwn yn atal gweithgaredd tyrosinase yn uniongyrchol heb effeithio ar lefelau mynegiant genynnau, gan nodi bod glwcos yn cael effaith gwrth-melanogenig mewn melanocytes trwy anactifadu tyrosinase anuniongyrchol yn dibynnu ar gynhyrchu asid lactig. Fodd bynnag, mae angen arbrofion pellach i ddilysu rôl asid lactig a glwcos mewn debigmentu.

Mae data cyfunol o'r astudiaeth hon yn darparu tystiolaeth ragarweiniol sy'n cefnogi defnyddioldeb glwcos argroenol fel gwynnu effeithiol yn ogystal ag adweithydd lleithio y gellir ei ddefnyddio'n ddiogel mewn colur a fformiwleiddiad meddyginiaethol.

4. Defnyddiau a Dulliau

4.1. Defnyddiau

Prynwyd D-glucose, -MSH, asid kojic (KA), L-tyrosine, L-DOPA, ac asid lactig gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, UDA). Prynwyd gwrthgyrff yn erbyn tyrosinase ac actin oddi wrth Abcam (Caergrawnt, DU). Prynwyd gwrthgorff yn erbyn Tyrp-1 gan Santa Cruz Biotechnology (CA, UDA). Prynwyd gwrthgorff yn erbyn MITF oddi wrth Proteintech (dinas, IL, UDA).

4.2. Assay Diwylliant Cell a Hyfywedd

Fe brynon ni gelloedd melanoma murine B16, cyfrwng Eagle wedi'i addasu (DMEM) ag Dulbecco, a serwm buchol ffetws (FBS) o'r American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, UDA). Cafodd celloedd B16 eu meithrin mewn DMEM sy'n cynnwys 4500 mg/L glwcos uchel (ATCC 30-2002) fel yr argymhellwyd gan y gwneuthurwr (ATCC) wedi'i ategu â 5 y cant FBS, a'i ddeor ar 37 ◦C mewn awyrgylch llaith yn cynnwys 95 y cant o aer a 10 y cant CO2. Prynwyd NHMs cynradd pigmentog tywyll gan Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, UDA). Cafodd celloedd eu meithrin mewn 254 ◦C Canolig (#M254500) wedi'u hategu ag Atodiad Twf Melanosyt Dynol (#S0025) a'u deor ar 37 ◦C o dan atmosffer 5 y cant o CO2. Ar gyfer arbrofion, defnyddiwyd NHMs cynradd rhwng darnau 4 a 7. Aseswyd hyfywedd celloedd diwylliedig gan ddefnyddio Pecyn Cyfrif Cell-8 (CCK-8) fel y disgrifiwyd gan y gwneuthurwr (DOJINDO, Tokyo, Japan).

4.3. Mesur Cynnwys Melanin

Penderfynwyd ar gynnwys melanin fel y disgrifiwyd mewn adroddiadau blaenorol [2-4]. Yn gryno, cafodd celloedd B16 eu trin â'r crynodiadau glwcos a nodwyd ym mhresenoldeb -MSH (200 nM) am 72 h. Cafodd NHMs eu trin â'r crynodiadau a nodwyd o glwcos am 4 d. Wedi hynny, golchwyd pob cell â halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) a'i diddymu mewn 1 N NaOH ar 60 ◦C am 1 h. Trosglwyddwyd lysates cell i 96-blat ffynnon, a mesurwyd amsugnedd ar 405 nm. Cafodd y gwerthoedd eu normaleiddio ar sail y crynodiadau protein ym mhob sampl yn dda.

4.4. Assay Gweithgaredd Tyrosinase Madarch

Fe wnaethom ymchwilio i effeithiau uniongyrchol y crynodiadau o glwcos a nodwyd ar weithgaredd tyrosinase madarch. Yn gryno, cymysgwyd 100 µL o glustogfa ffosffad yn cynnwys glwcos â thyrosinase madarch (10 uned/ffynnon) a'i gyfuno â 50 µL o 0.03 y cant L-tyrosine neu L-DOPA mewn dŵr distylliedig. Yna, deorwyd y gymysgedd gyda'i gilydd ar 37 ◦C am 10 munud, a mesurwyd amsugnedd ar 405 nm. Defnyddiwyd asid Kojic (KA), asiant gwrth-tyrosinase adnabyddus, fel cyfansawdd cyfeirio.

4.5. Assay Gweithgaredd Tyrosinase Mewngellog

Yn gryno, cafodd celloedd B16 neu NHMs eu trin â'r crynodiadau glwcos a nodwyd ar gyfer yr amseroedd a nodwyd. Yna, golchwyd celloedd â PBS a'u gorchuddio trwy ddeor mewn byffer ffosffad 50 mM (pH 6.8) yn cynnwys 1 y cant Triton X-100 a 0.1 mM fflworid ffenylmethyl-sulfonyl. Yna cafodd lysates cellog eu centrifugio ar 12,000 rpm ar 4 ◦C am 20 munud. Casglwyd y supernatant sy'n cynnwys tyrosinase cellog a phenderfynwyd y cynnwys protein ar gyfer normaleiddio. Deorwyd y darn cellog â L-DOPA mewn byffer ffosffad a chafodd ffurfiant dopacrom ei fonitro trwy fesur amsugnedd ar 405 nm o fewn 30 munud.

4.6. Arwahanrwydd RNA ac Adwaith Cadwyn Trawsgrifio-Polymerase Gwrthdro Meintiol Amser Real (qRT-PCR)

Er mwyn pennu mynegiant mRNA cymharol genynnau dethol, ynysu cyfanswm RNA â TRIzol (Invitrogen, CA, UDA), yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr, a thrawsgrifiwyd 4 µg RNA yn cDNA gan ddefnyddio RT-premix (Bioneer, Seoul, De). Corea). Perfformiwyd PCR meintiol gan ddefnyddio System PCR Cyflym Amser Real ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Prynwyd y setiau paent preimio qRT-PCR ar gyfer tyrosinase a Tyrp-1 oddi wrth Applied Biosystems, a defnyddiwyd citiau Assay Expression Generation TaqMan (Cymhwysol Biosystems) ar gyfer ymhelaethu. Cafodd mynegiant genynnau targed ei normaleiddio i fynegiant y genyn cadw tŷ sy'n amgodio protein coesyn ribosomaidd is-uned P0 (RPLP0). Perfformiwyd meintioli cymharol gan ddefnyddio'r dull ∆∆Ct cymharol yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.

4.7. Blotio Gorllewinol

Roedd celloedd yn cael eu golchi ddwywaith gyda PBS oer ac yna'n cael eu gorchuddio mewn byffer RIPA wedi'i addasu mewn oerfel iâ (Cell Signaling Technology, MA, UDA) sy'n cynnwys atalyddion proteas (Calbiochem, La Jolla, CA, UDA). Penderfynwyd ar gyfanswm crynodiad protein, a chafodd y proteinau eu datrys gan SDS-PAGE ar geliau Bis-Tris graddiant 4-12 y cant (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, UDA), a drosglwyddwyd i bilenni nitrocellulose (Thermo Fisher Scientific). Ar ôl trosglwyddo, cafodd pilenni eu rhwystro mewn datrysiad blocio 5 y cant. Deorwyd pilenni â gwrthgyrff cynradd ar 4 ◦C am 24 h, eu golchi â halwynog wedi'i glustogi gan Tris sy'n cynnwys 0.1 y cant Tween-20 (TBST), a'u hamlygu i wrthgyrff eilaidd peroxidase-conjugated am 1 h. ar dymheredd ystafell. Cafodd pilenni eu rinsio deirgwaith gyda TBST. Datblygwyd signal cemiluminescent gan ddefnyddio adweithydd ECL blotio Gorllewinol (GE Healthcare, Hatfield, UK).

4.8. Tri Dimensiwn (3D) Cyfwerth â Chroen Dynol

Defnyddiwyd MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, UDA) fel model meinwe croen dynol. Roedd y cyfwerth croen dynol 3D hyfyw, ailgyfansoddedig hwn yn deillio o roddwyr du ac mae'n cynnwys melanocytes a keratinocytes arferol. Tyfwyd MelanoDerm ar y rhyngwyneb aer-hylif yn EPI-100-NMM-113 cyfrwng (MatTek Corp, Ashland, MA, UDA). Cyn triniaeth glwcos, golchwyd meinweoedd ag 1 ml PBS i gael gwared ar gyfansoddion gweddilliol. Diddymwyd glwcos yn PBS. Y crynodiad terfynol o glwcos oedd 2 y cant. Dim ond gyda PBS y cafodd y sampl reoli ei thrin. Cymhwyswyd glwcos i MelanoDerm ar ddiwrnodau 1, 4, 6, 8, 11, 13, a 15. Ar ôl 18 diwrnod, gosodwyd meinweoedd MelanoDerm mewn fformaldehyd clustogog 4 y cant, wedi'i fewnosod mewn paraffin, wedi'i dorri i drwch o 3 µm, a'i ddarostwng i staenio H&E a F&M. Aseswyd hyfywedd y samplau meinwe gan ddefnyddio Pecyn Cyfrif Cell-8 (CCK-8) fel y disgrifiwyd gan y gwneuthurwr (DOJINDO, Tokyo, Japan). Aseswyd pigmentiad y MelanoDerm trwy gymharu'r newid yn y gwerth L*.

4.9. Delweddu Fflworoleuedd Cyffro Dau Ffoton (TPEF).

Er mwyn delweddu dosbarthiad melanin yn yr hyn sy'n cyfateb i groen dynol 3D, gwnaethom berfformio delweddu TPEF, fel y disgrifir yn ein hadroddiadau blaenorol [3,4]. Yn gryno, gosodwyd pob paratoad MelanoDerm mewn 4 y cant formalin am 24 h ar 4 ◦C ac yna golchi gyda PBS / 0.1 y cant BSA (albwm serwm buchol, Merck, Branchburg, NJ, UDA). Cafodd y delweddau TPEF eu caffael o'r haen waelodol i fesur melanin mewngellol yn yr haen melanocyte. Mesurwyd dwyster signal TPEF cymharol ar gyfer melanin yn y cyfaint mesur gan ddefnyddio meddalwedd Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, UDA).

4.10. Assay L-lactad

Cafodd celloedd B16 eu hadu ar 1.0 × 105 o gelloedd fesul ffynnon mewn 12-plât ffynnon. Ar ôl triniaeth â glwcos am 3 diwrnod, mesurwyd lefelau lactad allgellog gan ddefnyddio pecyn profi lliwimetrig L-lactad (Abcam, ab65331, Caergrawnt, DU) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr.

4.11. Dadansoddiad Ystadegol

Mynegir data fel modd ± SDs (gwyriadau safonol), a phenderfynwyd arwyddocâd ystadegol gan brawf-t Myfyriwr. Ystyriwyd bod gwerth-p < 0.05 yn ystadegol arwyddocaol.

Cyfraniadau Awdur:

Cysyniadoli, H.-JK, JL, a CSL; Curadu data, SHL; Ymchwiliad, SHL; Methodoleg, SHL, I.-HB, ac E.-SL; Goruchwyliaeth, JL, a CSL; Ysgrifennu - drafft gwreiddiol, SHL, a CSL; Ysgrifennu — adolygu a golygu, JL Mae pob awdur wedi darllen a chytuno i fersiwn gyhoeddedig y llawysgrif.

Ariannu:

Ariannwyd yr ymchwil hon gan y Rhaglen Ymchwil Gwyddoniaeth Sylfaenol trwy Sefydliad Ymchwil Cenedlaethol Corea (NRF) a ariennir gan y Weinyddiaeth Addysg (Rhif Grant: 2018R1D1A1B07049402).

Gwrthdaro Buddiannau:

Nid yw'r awduron yn datgan unrhyw wrthdaro buddiannau.

Byrfoddau

-MSH -melanocyte-ysgogol hormon

Tyrp{0}} protein sy'n gysylltiedig â thyrosinase 1

Ffactor trawsgrifio sy'n gysylltiedig â microphthalmia MITF

melanocytes dynol arferol yr NHM

fflworoleuedd cyffro dau ffoton TPEF

LXR afu X derbynnydd

Asidau alffa hydroxy AHAs

H&E hematocsilin ac eosin

F&M Fontana-Masson

Cyfeiriadau

1. Swalwell, H. ; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Ymchwilio i rôl melanin mewn cynhyrchu ROS cellog a mitocondriaidd UVA/UVB a hydrogen perocsid a niwed DNA mitocondriaidd mewn celloedd melanoma dynol. Radic Rhad. Biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]

2. Lee, CS; Jang, WH; Parcb, M.; Jung, K. ; Baek, HS; Joo, YH; Parc, YH; Lim, KM Mae deilliad adamantyl benzylbenzamide nofel, AP736, yn atal melanogenesis trwy atal ffactor trawsgrifio cAMP-PKA-CREB-Activated microphthalmia-Cysylltiedig a mynegiant tyrosinase. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Parc, NH; Rho, HS; Kim, YJ; O, SG; et al. Effeithlonrwydd Antimelanogenig Melasolv (3,4,5-Ester Thymol Trimethoxycinnamate) mewn Melanocytes a Chyfwerth â Chroen Dynol Tri Dimensiwn. Ffarmacol y Croen. Physiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]

4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS Mae lipidau Mannosylerythritol yn atal melanogenesis trwy atal signalau ERK-CREB-MITF-Tyrosinase mewn melanocytes dynol arferol a chyfwerth â chroen dynol tri dimensiwn. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]

5. Bin, BH; Kim, ST; Bhin, J. ; Lee, TR; Cho, EG Datblygiad asiantau gwrth-Melanogenig sy'n seiliedig ar siwgr. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]

6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Atalyddion Melanogenesis. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]

7. Ando, ​​H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Clyw, VJ Dulliau o nodi atalyddion biosynthesis melanin trwy reoli ansawdd tyrosinase. J. Buddsoddi Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]

8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, FY; Yoon, TJ Amhariad ar glycosylation tyrosinase gan N-acetylglucosamine a'i effeithiau depigmenting mewn croen mochyn cwta a chroen dynol. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]

9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Effeithiolrwydd depigmentation asid galacturonig trwy reoleiddio tyrosinase mewn celloedd melanoma murine B16 a chroen dynol tri dimensiwn cyfatebol. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]

10. Nakamura, A.S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Effeithiau carbohydrad cylchol di-Cyclodextrin ar gelloedd melanoma llygoden: Nodweddu math newydd o siwgr hypopigmented. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]

11. Khan, MT Atalyddion tyrosinase newydd rhag adnoddau naturiol – Eu hastudiaethau cyfrifiannol. Curr. Med. Cemeg. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]

12. Solano, F. ; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: Adolygiad wedi'i ddiweddaru ar agweddau biolegol, cemegol a chlinigol. Pigment. Cell. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Parcb, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Parc, NH; Lee, JH; Parc, YH; Shin, SS; et al. Effeithiau gwahanol pum cyfansoddyn dad-bigmentaidd, rhododendron, ceton mafon, monobenzone, rucinol, ac AP736 ar melanogenesis a hyfywedd melanocytes epidermaidd dynol. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]

14. Mulukutla, CC; Khan, S.; Lange, A. ; Hu, WS Metabolaeth glwcos mewn diwylliant celloedd mamalaidd: Mewnwelediadau newydd ar gyfer addasu llwybrau vintage. Tueddiadau. Biotechnol. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]

15. Usuki, A. ; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y. ; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. Effaith ataliol asid glycolig ac asid lactig ar synthesis melanin mewn celloedd melanoma. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]

16. Lin, S. ; Li, L. ; Li, M. ; Gu, H. ; Chen, X. Mae Raffinose yn cynyddu awtoffagy ac yn lleihau marwolaeth celloedd mewn keratinocytes UVB-Arbelydredig. J. Photochem. Ffotobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]

17. Chen, X. ; Li, M. ; Li, L. ; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M. ; Huang, J.; Chen, K.; Mae Gu, H. Trehalose, swcros, a raffinose yn ysgogwyr newydd o awtophag mewn keratinocytes dynol trwy lwybr mTOR-Annibynnol. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]

18. Yamada, K. ; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Glwcos Argroenol yn Cymell Mynegiant Claudin-1 a Filaggrin mewn Model Llygoden o Ddermatitis Atopig ac mewn Diwylliant Keratinocyte, Yn Cael Effeithiau Gwrthlidiol trwy Atgyweirio Gweithrediad Rhwystrau Croen. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]

19. Spravchikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Effeithiau glwcos ar keratinocytes croen: Goblygiadau ar gyfer cymhlethdodau croen diabetes. Diabetes 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]

20. Castrillo, A. ; Tontonoz, P. Derbynyddion niwclear mewn bioleg macrophage: Ar groesffordd metaboledd lipid a llid. Annu. Cell y Parch. Dev. Biol. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]

21. Lee, CS; Parcb, M.; Han, J. ; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Mab, ED; Parc, YH; Mae actifadu derbynnydd Lim, KM Liver X yn atal melanogenesis trwy gyflymu diraddiad MITF ERK-Mediated. J. Buddsoddi. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]

22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L. ; Godio, C. ; Hampton, E.; Molteni, V. ; Kreusch, A. ; Saez, E. Mae'r derbynnydd niwclear LXR yn synhwyrydd glwcos. Natur 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]

23. Schurr, A. Carbohydrad; IntechOpen: Llundain, DU, 2017; tt 21–35.

24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C. ; Chiang, G. ; Ronai, Z. ; Osterman, A. ; Smith, J. Proffilio fflwcs metabolig cymharol o linellau celloedd melanoma: Y tu hwnt i effaith Warburg. J. Biol. Cemeg. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]

25. Tang, SC; Yang, JH Effeithiau Deuol Asidau Alffa-Hydroxy ar y Croen. Moleciwlau 2018, 23, 863. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com