Mae Echel yr Arennau Hepcidin/ferroportin yn Rheoli Ail-amsugno Haearn ac yn Pennu Maint Gorlwytho Arennau A Haearn Systemig
Mar 02, 2022
Cyswllt: emily.li@wecistanche.com
Goran Mohammad1, Athena Matakidou2, Peter A. Robbins1, a Samira Lakhal-Littleton1
GEIRIAU ALLWEDDOL:ferroportin; hemochromatosis; hepcidin; haearn; gorlwytho haearn;arennoltiwbyn
Ferroportin (FPN) yw'r unig brotein allforio haearn mamalaidd hysbys. Mae'n cyfryngu rhyddhau haearn i'r cylchrediad o enterocytes dwodenol a macroffagau reticuloendothelial splenig, safleoedd priodol amsugno haearn ac ailgylchu.1,2 Mae rhyddhau haearn trwy gyfrwng FPN yn cael ei elyniaethu gan yr hormon hepcidin, a elwir hefyd yn peptid gwrthficrobaidd hepcidin (HAMP). Wedi'i gynhyrchu'n bennaf yn yr afu, mae hepcidin yn rhwymo ac yn cymell mewnoli FPN, a thrwy hynny gyfyngu ar ryddhau haearn i'r cylchrediad a'i argaeledd i feinweoedd ymylol.3,4 Felly, mae'r echel HAMP / FPN yn gweithredu yn y safleoedd amsugno ac ailgylchu i reoli systemig cartrefostasis haearn.
Yr aren yw safle adamsugno haearn. Gall haearn nad yw'n rhwym i drosglwyddiad a haearn wedi'i rwymo â throsglwyddiad groesi i'r ffiiltrad glomerwlaidd.5 Mae'r mwyafrif helaeth o'r haearn hwn yn cael ei gymryd yn ôl i'r epithelia tiwbaidd. Mae nifer o gludwyr wedi'u cysylltu â'r aildderbyn hwn, gan gynnwys cyfadeilad derbynnydd megalin-ciwbilin multiligand, derbynnydd trosglwyddydd 1, cludwr metel deufalent 1, cludwr sinc ZIP8, a chludwr sinc ZIP14.5-10.
Unwaith yn yarennolepithelia, mae haearn yn cael ei adamsugno i'r cylchrediad. Mae FPN yn doreithiog yn yarenac mae wedi'i gysylltu ag adamsugno haearn.11–14 Fodd bynnag, nid yw'n hysbys o hyd a yw HAMP arennol hefyd yn cael ei reoleiddio gan HAMP mewndarddol o dan amodau ffisiolegol arferol, ac os felly, a yw rheoliad o'r fath yn bwysig ar gyfer homeostasis haearn systemig a/neu arennol.
I fynd i'r afael â'r cwestiynau hyn, fe wnaethom gynhyrchu model llygoden newydd gydag anwythadwyarennoltiwbyn–cnoi-mewn penodol o fpnC326Y, sy'n amgodio protein FPNC326Y sy'n gwrthsefyll HAMP. Yn ogystal, i gadarnhau rôl FPN a adroddwyd yn flaenorol mewn adamsugniad haearn, fe wnaethom hefyd gynhyrchu model llygoden gydag anwythadwyarennoltiwbyn– dileu'r genyn fpn yn benodol. Mae ein canlyniadau'n dangos bod HAMP mewndarddol yn rheoleiddio amsugno haearn trwy gyfrwng FPN yn uniongyrchol a bod y rheoliad hwn yn bwysig i'r ddau.arennola homeostasis haearn systemig, yn enwedig yn y lleoliad o argaeledd haearn gormodol.
Yr astudiaeth hon yw'r gyntaf i ddefnyddio llygod sy'n cynnal colled arennol penodol o ymatebolrwydd HAMP i bennu'n ffurfiol ypwysigrwyddo'rarennolEchel HAMP/FPN. Mae'n rhoi mewnwelediadau newydd i rôl adamsugno haearn wrth bennu graddau'r gorlwytho haearn arennol ac allrenol wrth osod hemochromatosis.
DULLIAU
Llygod
Roedd yr holl weithdrefnau anifeiliaid yn cydymffurfio â Deddf Anifeiliaid Swyddfa Gartref y DU (Gweithdrefnau Gwyddonol) 1986 ac wedi'u cymeradwyo gan Bwyllgor Adolygu Moesegol Is-adran Gwyddorau Meddygol Prifysgol Rhydychen.
Cynhyrchwyd yr alelau fpnflfl ac fpnC326Yflfl amodol fel y disgrifiwyd yn flaenorol.15,16
Roedd llygod yn llochesu'r Pax8.CreERT2þ transgene yn anrheg gan Dr. Athena Matakidou, Sefydliad Ymchwil Canser y DU Caergrawnt, Prifysgol Caergrawnt. Cynhyrchwyd y llygod hyn fel y disgrifiwyd yn flaenorol.17 Roedd pob llygoden ar gefndir C57BL/6.
Deietau
Oni nodir yn wahanol, roedd anifeiliaid yn cael diet cnofilod safonol yn cynnwys 200 rhan fesul miliwn (ppm) haearn. Mewn arbrofion trin haearn, rhoddwyd diet llawn haearn i lygod (5000-ppm iron; Teklad TD.140464) neu ddeiet rheoli cyfatebol (200- haearn ppm; Teklad TD.08713) o ddiddyfnu am 3 misoedd.
Meintoli haearn a mynegeion haearn
Pennwyd lefelau haearn serwm a ferritin gan ddefnyddio system ABXPentra (Horiba Medical). Pennwyd gwerthoedd haemoglobin gan HemoCue Hb 201 Hemoglobin Microcuvettes. Mesurwyd lefelau serwm erythroferrone gan assay immunosorbent-gysylltiedig ag ensymau (Gwyddorau Bywyd Cynhenid). Perfformiwyd y broses o bennu cyfanswm haearn elfennol mewn meinweoedd gan sbectrometreg màs plasma wedi'i gyplysu'n anwythol, fel y disgrifiwyd yn flaenorol.15,16,18 Cyflawnwyd graddnodi gan ddefnyddio'r broses o adio safonol, lle mae pigau o 0 ng/g, 0.5 ng/ ychwanegwyd g, 1 ng/g, 10 ng/g, 20 ng/g, a 100 ng/g haearn at atgynhyrchiadau o sampl dethol. Cafodd safon haearn allanol (Safonau Purdeb Uchel ICP-MS-68-atebiad) ei wanhau a'i fesur i gadarnhau dilysrwydd y graddnodi. Roedd rhodiwm hefyd yn cael ei sbeicio ar bob sampl wag, safonol, a sampl fel safon fewnol ar grynodiad o 1 ng/g. Ar gyfer meintioli haearn wrinol, casglwyd wrin o lygod dros gyfnod o 24 awr, ac yn amodol ar sbectrometreg màs plasma wedi'i gyplysu'n anwythol. Mesurwyd lefelau creatinin yn yr un samplau gan ddefnyddio pecyn assay creatinin lliwimetrig (Abcam; ab65340), a normaleiddiwyd gwerthoedd haearn i grynodiad creatinin.
Imiwnohistocemeg
Perfformiwyd gwrthimiwnedd fflworoleuedd mewn adrannau meinwe wedi'u mewnosod â pharaffifin, wedi'u gosod mewn fformalin, gan ddefnyddio gwrthgorff FPN (Novus Biologicals; NBP1-21502) yn 1:100 a gwrthgorff Pro-Hepcidin (AA 39-59) yn 1:50 (Gwrthgyrff Ar-lein; ABIN350367). Cadarnhawyd manylebau'r gwrthgyrff FPN a hepcidin gan ddefnyddio anifeiliaid Fpnflfl / flfl, Pax8.CreERT2þ ac anifeiliaid Hamp -/- fel rheolaethau negyddol, yn y drefn honno (Ffigur Atodol S1). Cafodd marcwyr segment arennol eu hadnabod gan ddefnyddio gwrthgorff aquaporin -1 yn 1:200 (Biotechne; NB600- 749), gwrthgorff aquaporin-2 am 1:200 (Biotechne; NBP1-70378), neu wrthgorff calbindin am 1:100 (Abcam; ab82812). Gwrthgyrff eilaidd oedd IgG Alexa Fluor gwrth-gwningen-488 (Abcam; ab150073), gwrthdonci IgG Cy3 (Abcam; ab6949), a gwrth-lygoden IgG Alexa568 (Abcam; ab175473). Delweddwyd sleidiau gan ddefnyddio microsgop Olympus FV1000.
gall cistanche amddiffynarenswyddogaeth
Blotio gorllewinol
Roedd meinweoedd yn snap wedi'i rewi mewn nitrogen hylifol, wedi'i falu, ac yna'n cael ei lysio gan ddefnyddio System Buffer Lysis RIPA (Santa Cruz; sc-24948), yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cliriwyd lysadau meinwe trwy allgyrchiad ar 15 000g am 10 munud ar 4 C. Mesurwyd crynodiad protein yn y lysadau gan Assay Protein BCA (Pierce; 23225) a'i normaleiddio i'r un crynodiad ar gyfer pob swp. Yna cafodd Lysadau eu gwanhau mewn byffer sampl sodiwm dodecyl sylffad nad yw'n lleihau Laemmli a'i gynhesu ar 95 C am 5 munud. Llwythwyd protein (30-50 mg) ar Geli TGX Mini-PROTEAN (Biorad; 4561096). Ar ôl electrofforesis, trosglwyddwyd protein i bilen diflflworid polyvinylidene gan ddefnyddio system BioRad Translotter, a rhwystrwyd pilenni am awr mewn byffer blocio sy'n cynnwys albwmin serwm buchol 5 y cant. Yna cafodd pilenni eu staenio dros nos ar 4 C gyda gwrthgorff FPN gwrth-lygoden polyclonaidd cwningen (NBP1-21502; Novus Biologicals) am 1:1000 neu marchruddygl peroxidase - gwrthgorff gwrth-b-actin cyfun (Proteintech; HRP{{18} }) am 1:5000. Datblygwyd blots gan ddefnyddio pecyn canfod cysefin ECL (RPN2232; VWR International). Mesurwyd dwyster signalau gan ImageJ, a chyfrifwyd y gymhareb rhwng yr FPN a'r signalau b-actin i gynhyrchu dwyster normaleiddio.
Diaminobenzidine (DAB) - staen Perls wedi'i wella
Cafodd adrannau meinwe wedi'u gwreiddio â pharaffiffin, a oedd wedi'u gosod mewn fformalin, eu dadbaraffifin gan ddefnyddio xylene, ac yna eu hailhydradu mewn ethanol. Yna cafodd sleidiau eu staenio am 1 awr gyda 1 y cant o potasiwm ferricyanid mewn byffer HCl 0.1 mol/L. Cafodd gweithgaredd peroxidase mewndarddol ei ddiffodd, ac yna cafodd sleidiau eu staenio â swbstrad cromogen DAB a'u gwrth-staenio â hematoxylin. Cawsant eu delweddu gan ddefnyddio microsgop golau-fifield safonol.
Adwaith Cadwyn Polymerase Meintiol
Mesurwyd mynegiant genynnau gan ddefnyddio chwilwyr assay mynegiant TaqMangene Biosystems Cymhwysol ar gyfer Hamp a bactin genyn cadw tŷ (Life Technologies). Cafodd gwerth y cylch trothwy (CT) ar gyfer y genyn o ddiddordeb ei normaleiddio'n gyntaf trwy ddidynnu gwerth CT ar gyfer b-actin i gael gwerth DCT. Cafodd gwerthoedd DCT samplau prawf eu normaleiddio ymhellach i gyfartaledd y gwerthoedd DCT ar gyfer samplau rheoli i gael gwerthoedd DDCT. Yna cyfrifwyd lefelau mynegiant genynnau cymharol fel 2-DDCT.
Ystadegau
Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig. Perfformiwyd cymariaethau mewn parau gan ddefnyddio prawf Student t. Tynnwyd cymariaethau lluosog gan ddefnyddio dadansoddiad o amrywiant. Profion post hoc yn defnyddio cywiro Bonferroni.
Ffigur 1|Mae'r echel hepcidin / ferroportin (FPN) mewn tiwbiau arennol yn rheoli adamsugniad haearn ac mae'n bwysig ar gyfer homeostasis haearn arennolmewn llygod benywaidd. (a)Delweddau cynrychioliadol o staenio immunofluorescent ar gyfer FPN, aquaporin 1 (AQP1), aquaporin 2 (AQP2), a Calbindin (CalD) yn arennau llygod math gwyllt. Barrau ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol 10. Panel diwedd, bar¼ 25mm, chwyddhad gwreiddiol 60. (b) Blot gorllewinol ar gyfer FPN ynarennauo reolaethau FpnC326Yflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd, Pax8.CreER T2 þ llygod a FpnC326Y flfl/flfl 1 wythnos ar ôl triniaeth tamoxifen. Dangosir meintioli dwyster y signal yn y panel gwaelod. (c) Blot gorllewinol ar gyfer FPN mewn arennau Fpnflfl/ flfl, Pax8.CreERT2þ llygod a rheolaethau Fpnflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd 1 wythnos ar ôl triniaeth tamoxifen. Dangosir meintioli dwyster y signal yn y panel gwaelod. (d) Lefelau haearn arennol mewn FpnC326Y benywaidd a gwrywaiddflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ llygod a FpnC326Yflfl/flfl rheolaethau ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. (e) Delweddau cynrychioliadol o staen haearn Perls wedi'i wella â diaminobenzidine (DAB) yn rhanbarth cortigol arennol anifeiliaid cyfatebol ar ôl tri mis ar ôl ymsefydlu tamoxifen. Barrau ¼ 200 mm, chwyddwydr gwreiddiol 10. (dd) Lefelau haearn arennol mewn rheolyddion Fpnflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd, Pax8.CreERT2þ a Fpnflfl/flfl ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl anwythiad tamoxifen. (g) Delweddau cynrychioliadol o staen haearn Perls wedi'i wella gan DAB yn rhanbarth cortigol arennol anifeiliaid cyfatebol 3 mis ar ôl anwythiad tamoxifen. (Parhad)
Ffigur 1 |(Parhad) Barrau ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol 10. (f) Lefelau haearn serwm mewn rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ a llygod FpnC326Yflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. (i) Lefelau haearn serwm mewn rheolyddion Fpnflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ a llygod Fpnflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl anwythiad tamoxifen. Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" a="" ****p="">< 0.0001.="" b-="" act,="" b-actin;="" parhad,="" rheolaeth;="" dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-ffenylindole;="" ppm,="" rhannau="" y="" filiwn.="" i="" wneud="" y="" gorau="" o'r="" ddelwedd="" hon,="" gweler="" y="" fersiwn="" ar-lein="" o'r="" erthygl="" hon="" yn="">
CANLYNIADAU
Mae'r echel hepcidin / FPN mewn tiwbiau arennol yn rheoli adamsugno haearn ac mae'n bwysig ar gyfer homeostasis haearn arennol mewn llygod benywaidd
Yn gyntaf fe wnaethom geisio sefydlu union safle mynegiant Hysbysiad Cosb Benodedig yn yaren. I'r perwyl hwnnw, fe wnaethom gostained arennau llygoden ar gyfer FPN a marcwyr segment-benodol aquaporin 1 (marcwr tiwbiau troellog procsimol ac aelod disgynnol tenau Henley), aquaporin 2 (marcwr o gasglu dwythellau a thiwbiau cysylltu), a calbindin (marciwr). o diwbiau troellog distal a dwythellau cysylltu a chasglu cortigol). Canfuom fod FPN wedi'i fynegi'n gryf yn y cortecs, gan gydleoli ag aquaporin 1 i'r tiwbiau troellog procsimol. Roedd rhywfaint o Hysbysiad Cosb Benodedig yn y medwla mewnol, yn cydleoli ag aquaporin 2 i'r dwythellau casglu medullary. Nid oedd unrhyw FPN wedi'i gydleoli â calbindin (Ffigur 1a; dangosir y panel mwy yn Ffigur Atodol S2). Mae'r canlyniadau hyn yn cadarnhau bod FPN ar ei fwyaf helaeth yn y rhanbarth cortigol o fewn tiwbiau troellog agos.
Er mwyn penderfynu a yw FPN arennol yn cael ei reoleiddio gan HAMP, fe wnaethom ddefnyddio llygod sy'n cadw trawsgen taro-i-mewn Pax8.CreERT2þ, sy'n gyrru mynegiant tamoxifen-inducible o'r recombinase Cre o dan reolaeth hyrwyddwr blwch pâr genyn 8 pax8 mewn tiwbiau procsimol a distal ac mewn casglu dwythellau.17 Croesasom lygod Pax8.CreERT2þ â'r rhai sy'n llochesu alel fflloxed fflloxed amodol FpnC326Y, sy'n amgodio FPN sy'n gwrthsefyll hepcidin. Yn ogystal, ac i gadarnhau rôl FPN arennol yr adroddwyd amdani yn flaenorol mewn adamsugniad haearn, fe wnaethom groesi llygod Pax8.CreERT2þ gyda llygod yn llochesu'r alel Fpnflfl/flfl. Wythnos yn dilyn triniaeth tamoxifen i gymell y trawsgene Pax8.CreERT2, cynyddwyd lefelau FPN arennol mewn llygod FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ benywaidd a gwrywaidd o gymharu â rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl (Ffigur 1b), gan ddangos bod rheoliad arennol yn amodol ar FPN HAMP mewndarddol o dan amodau ffisiolegol arferol, ac yn ogystal â chadarnhau effeithiolrwydd y Pax8.CreERT2þ transgene. I'r gwrthwyneb, gostyngwyd lefelau FPN arennol mewn llygod Fpnflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd, Pax8.CreERT2þ o'u cymharu â rheolaethau Fpnflfl/flfl, gan gadarnhau ymhellach effeithiolrwydd y transgene Pax8.CreERT2þ (Ffigur 1c). Cadarnhawyd manylder y Pax8.CreERT2þ transgene hwn hefyd gan bresenoldeb yr alel dileu (DFpn) yn yarenond nid yn iau neu ddueg llygod Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ (Ffigur Atodol S2A).
Nesaf, aethom ati i benderfynu a yw echel HAMP / FPN arennol yn rheoli adamsugno haearn. I'r perwyl hwnnw, fe wnaethom fesur lefelau haearn arennol a serwm ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. Canfuom fod haearn arennol
roedd y cynnwys yn is yn FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ benywod nag yn FpnC326Yflfl/flfl benywod rheoli ar bob pwynt amser (Ffigur 1d). Nid oedd cynnwys haearn arennol mewn gwrywod yn wahanol yn ôl genoteip (Ffigur 1d). Cadarnhaodd staen haearn Perl wedi'i wella gan DAB hefyd y gostyngiad mewn lefelau haearn o fewn tiwbiau procsimol o ferched FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ (Ffigur 1e; dangosir y panel mwy yn Ffigur Atodol S2). I'r gwrthwyneb, canfuom fod cynnwys haearn arennol yn uwch mewn merched Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ nag mewn benywod rheoli Fpnflfl/flfl o 1 mis ymlaen (Ffigur 1f). Nid oedd cynnwys haearn arennol mewn gwrywod yn wahanol yn ôl genoteip (Ffigur 1f). Roedd staen haearn Perls wedi'i wella gan DAB hefyd yn cadarnhau bod haearn yn cronni o fewn tiwbiau procsimol o ferched Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ (Ffigur 1g; panel mwy a ddangosir yn Ffigur Atodol S2).
Cynyddwyd lefelau haearn serwm dros dro mewn llygod FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ gwrywaidd a benywaidd o gymharu â rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl ar 1- bwynt amser mis (Ffigur 1h). I'r gwrthwyneb, gostyngwyd lefelau haearn serwm mewn merched Fpnflfl/ flfl, Pax8.CreERT2þ o gymharu â benywod rheoli Fpnflfl/flfl ar 1- bwynt amser mis, tra eu bod yn parhau i fod yn gymaradwy mewn gwrywod o wahanol genoteipiau ar bob pwynt amser (Ffigur 1i ). Ni ellid priodoli adferiad lefelau haearn serwm i'r rhai a welwyd mewn anifeiliaid rheoli yn 3 mis oed i adfer lefelau FPN arennol arferol. Yn wir, roedd y newidiadau a achoswyd gan Pax8.CreERT2þ mewn lefelau FPN arennol yn dal i gael eu cynnal ar 3 mis ar ôl triniaeth tamoxifen (Ffigur Atodol S2B ac C). Lleihad mewn cynnwys haearn arennol a lefelau uwch o haearn serwm mewn merched FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ yn dangos bod adamsugniad haearn sy'n ddibynnol ar FPN mewn tiwbiau procsimol yn cael ei reoleiddio gan HAMP o dan amodau ffisiolegol arferol. Cynnydd yn y cynnwys haearn arennol a llai o haearn serwm yn Fpnflfl/flfl, mae menywod Pax8.CreERT2þ yn cadarnhau canfyddiadau blaenorol bod FPN arennol yn cyfrannu at adamsugno haearn. Yn ogystal, o dan amodau ffisiolegol arferol, mae'n ymddangos bod rheoli adamsugniad haearn gan yr echel HAMP/FPN arennol yn bwysicach mewn menywod nag mewn gwrywod, o leiaf yn y straen C57BL/6.
Gall cistanche wella gweithrediad yr arennau
Mae'r echel HAMP/FPN arennol yn cyfrannu at, ond nid yw'n hanfodol ar gyfer, homeostasis haearn systemig arferol o dan amodau argaeledd haearn arferol.
Nesaf, aethom ati i bennu cyfraniad yr echel HAMP/FPN arennol i homeostasis haearn systemig. Gwelsom fod gan FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ benywod gynnydd dros dro mewn serwm ferritin (Ffigur 2a), cynnwys haearn yr iau (Ffigur 2b), a chynnwys haearn dueg (Ffigur 2c) ar {{6} bwynt amser y mis pan o'i gymharu â merched rheoli FpnC326Yflfl/flfl. Roedd eu lefelau haemoglobin yn parhau i fod yn debyg i rai'r rheolyddion ar bob pwynt amser (Ffigur 2d). Nid oedd yr un o'r paramedrau hyn yn wahanol rhwng dynion FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ a'u rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl (Ffigur 2a–d). Nid oedd lefelau erythroferrone yn wahanol yn ôl genoteip (Ffigur Atodol 3A). I'r gwrthwyneb, canfuom fod gan fenywod Fpnflfl/ flfl , Pax8.CreERT2þ lefelau ferritin serwm is ar 1- a 3-pwyntiau amser mis (Ffigur 2e), cynnwys haearn yr iau yn is yn y 3- a 6-pwyntiau amser mis (Ffigur 2f), a chynnwys haearn dueg is ar 1- a 3-pwyntiau amser mis (Ffigur 2g), o'u cymharu â merched rheoli Fpnflfl/flfl. Cawsant hefyd ostyngiad byrhoedlog ac ysgafn mewn lefelau haemoglobin ar 3- bwynt amser mis (Ffigur 2h). Nid oedd yr un o'r paramedrau hyn yn wahanol rhwng gwrywod Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ a'u rheolyddion Fpnflfl/flfl (Ffigur 2e–h). Ni newidiwyd lefelau erythroferrone ychwaith yn ôl genoteip (Ffigur Atodol 3B). Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos, o dan amodau ffisiolegol arferol, bod yr echel HAMP/FPN arennol yn cyfrannu at lefelau haearn systemig ond nid yw ynddo'i hun yn hanfodol ar gyfer cynnal cartrefostasis haearn systemig arferol.
Ffigur 2|Mae'r echelin arennol peptid gwrthficrobaidd hepcidin / ferroportin (FPN) yn cyfrannu at, ond nid yw'n hanfodol ar gyfer, systemig arferolhomeostasis haearn o dan amodau argaeledd haearn arferol. (a-d)Mynegeion haearn systemig mewn rheolaethau FpnC326Yflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd, Pax8.CreERT2þ llygod a FpnC326Yflfl/flfl ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl triniaeth tamoxifen, gan gynnwys (a) serum ferritin, (b) cynnwys haearn yr afu , (c) cynnwys haearn ddueg, a (ch) haemoglobin. (e–h) Mynegeion haearn systemig mewn rheolaethau Fpnflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd, Pax8.CreERT2þ llygod a Fpnflfl/flfl ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl ymsefydlu tamoxifen, gan gynnwys (e) serum ferritin, ( dd) cynnwys haearn yr iau, (e) cynnwys haearn y ddueg, a (f) haemoglobin. Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" a="" ***p="">< 0.001.="" ppm,="" rhannau="" y="">
Ffigur 3|Mae echelin peptid gwrthficrobaidd hepcidin arennol (HAMP) / ferroportin (FPN) yn pennu maint gorlwytho haearn arennol a systemig o dan amodau argaeledd haearn gormodol. (a-f)Darparodd mynegeion haearn alltraenol mewn rheolaethau FpnC326Yflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd, Pax8.CreERT2þ a rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl naill ai ddiet chow rheoli (200 rhan y filiwn [ppm]) neu ddeiet llawn haearn (5000 ppm) am 3 mis. (Parhad)
Ffigur 3 |(Parhad) Mae mynegeion yn cynnwys (a) haearn serwm, (b) serum ferritin, (c) cynnwys haearn y ddueg, (d) cynnwys haearn y galon, (e) cynnwys haearn yr ysgyfaint, ac (dd) cynnwys haearn yr iau. (g) Cynnwys haearn arennol mewn FpnC326Yflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ llygod a rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd yn darparu naill ai diet chow rheoli (200 ppm) neuhaearn-lwythogdiet (5000 ppm) am 3 mis. (f,i) Delweddau cynrychioliadol o ddiaminobenzidine (DAB) - staen haearn Perls gwell yn yr iau a rhanbarth critigol arennol anifeiliaid cyfatebol. Barrau ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol 10. (j) Mynegiant cymharol o'r genyn hamb yn iau anifeiliaid cyfatebol. Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" ****p="">< 0.0001,="" *****p="">< 0.00001,="" a="" ******p="">< 0.000001.="" i="" wneud="" y="" gorau="" o'r="" ddelwedd="" hon,="" gweler="" y="" fersiwn="" ar-lein="" o'r="" erthygl="" hon="" yn="">
Mae'r echel HAMP / FPN arennol yn pennu maint y gorlwytho haearn arennol a systemig o dan amodau argaeledd haearn gormodol
Nesaf, aethom ati i bennu rôl yr echel HAMP / FPN arennol wrth osod gorlwytho haearn. I'r perwyl hwnnw, ysgogwyd rheolaethau anifeiliaid FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ a FpnC326Yflfl/flfl gyda tamoxifen ac yna darparwyd naill ai diet chow rheoli, yn cynnwys haearn 200 ppm, neu ddeiet llawn haearn, yn cynnwys 5000 ppm haearn, am 3 mis . Canfuom fod darparu diet llawn haearn yn cynyddu haearn serwm, serwm ferritin, a chynnwys haearn meinwe mewn gwrywod a benywod o'r ddau genoteip. Fodd bynnag, roedd gan anifeiliaid FpnC326Yflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ fwy o gynnydd mewn haearn serwm (Ffigur 3a), serum ferritin (Ffigur 3b), a chynnwys haearn yn y ddueg (Ffigur 3c), y galon (Ffigur 3d), yr ysgyfaint (Ffigur 3e) , ac afu (Ffigur 3f) na rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl. Mewn cyferbyniad, roedd ganddynt gynnydd is yn y cynnwys haearn arennol (Ffigur 3g). Roedd gwahaniaethau rhwng genoteipiau yn y graddau o lwytho haearn o fewn tiwbiau procsimol ac yn yr afu hefyd yn amlwg mewn staen haearn Perls wedi'i wella gan DAB (Ffigur 3h ac i; paneli mwy a ddangosir yn Ffigur Atodol S4). Yn unol â mwy o orlwytho haearn systemig, roedd gan anifeiliaid FpnC326Yflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ hefyd fwy o gynnydd ym mynegiant genynnau hambwrdd yr iau o gymharu â rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl (Ffigur 3j). Ni effeithiwyd ar lefelau biniau hemoglo gan ddeiet na genoteip, ac yn gyson â hyn, arhosodd lefelau serwm erythroferrone heb newid hefyd (Ffigur Atodol 4A a B). Mae'r canfyddiadau hyn yn dangos, o dan amodau argaeledd haearn gormodol, bod rheoli adamsugno haearn gan yr echel HAMP/FPN arennol yn lleihau gorlwytho haearn systemig tra'n cynyddu gorlwytho haearn arennol.
Mae'r echel HAMP/FPN arennol yn pennu patrwm gorlwytho haearn meinwe mewn hemochromatosis
Nesaf, aethom ati i archwilio rôl yr echel HAMP/FPN arennol yng nghyd-destun hemochromatosis etifeddol, cyflwr genetig o orlwytho haearn a achosir gan ddiffygion mewn cynhyrchu hepcidin neu ymatebolrwydd hepcidin.19 I'r perwyl hwnnw, defnyddiwyd llygod a gynhyrchwyd yn- ty yn gartref i gnociad hollbresennol heterosygaidd o'r alel fpnC326Y (Fpnwt/C326Y). Roeddem wedi dangos yn flaenorol bod y llygod hyn yn datblygu'r ffenoteip gorlwytho haearn sy'n nodweddiadol o hemochromatosis etifeddol.15,18 Cymharwyd patrwm meinwegorlwytho haearnyn y llygod hyn â'r hyn a welir mewn llygod tebyg i wyllt yn bwydo diet llawn haearn o ddiddyfnu am 3 mis. Roedd Fpnwt/ C326Ymice a llygod tebyg i wyllt yn bwydo diet llawn haearn wedi
mwy o haearn yn yr iau, y galon a'r ysgyfaint o gymharu â'u rheolyddion priodol (Ffigurau 4a a b). Roedd cynnwys haearn arennol yn Fpnwt/C326Ymice yn normal yn 3 mis oed (Ffigur 4a) a dim ond wedi cynyddu 32 y cant o gymharu â rheolaethau yn 6 mis oed (Ffigur Atodol 5A). Mewn cyferbyniad, roedd gan anifeiliaid math gwyllt a ddarparodd ddeiet llawn haearn gynnydd o 260 y cant yn y cynnwys haearn arennol o'i gymharu â'r rhai ar ddeiet arferol (Ffigur 4b). Roedd gwahaniaethau cymharol mewn gorlwytho haearn arennol ac afu rhwng y 2 fodel hefyd yn amlwg mewn staen haearn Perls DABenhanced (Ffigur 4c a d; paneli mwy a ddangosir yn Ffigur Atodol S5). Roedd maint y gorlwytho haearn allgyrchol yn debyg rhwng y 2 fodel, tra bod maint y gorlwytho arennol gryn dipyn yn uwch mewn anifeiliaid gwyllt a oedd yn darparu diet wedi'i lwytho â haearn nag mewn llygod Fpnwt/C326Y (Ffigur 4e). Cynyddwyd FPN yn y cortecs mewn llygod Fpnwt/C326Y ac roedd llygod math gwyllt yn darparu diet llawn haearn (Ffigur 4f a g; dangosir paneli mwy yn Ffigur Atodol S5). Datgelodd archwiliad agosach o safle mynegiant FPN mewn tiwbiau procsimol ei bod yn ymddangos ei fod yn lleoleiddio'n fewngellol yn ogystal ag i'r bilen fasochrol mewn llygod Fpnwt/C326Y. Mewn cyferbyniad, roedd yn ymddangos bod FPN yn lleoleiddio'n bennaf i'r cytoplasm, pilen apigol, ac yn rhyfeddol roedd y cnewyllyn mewn llygod yn darparu diet llawn haearn (Ffigur 4f a g, paneli is). Cadarnhawyd patrwm lleoleiddio FPN sy'n deillio o ddarparu diet llawn haearn gan ddefnyddio anifeiliaid Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ fel rheolaethau negyddol (Ffigur Atodol S5B). Mae'r arsylwadau hyn, ynghyd â'r canfyddiadau blaenorol bod gan anifeiliaid FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ lwythiad haearn arennol is na'r rheolyddion yn dilyn darparuhaearn-lwythogdiet, dangos bod colli gweithredu HAMP ar FPN arennol yn amddiffyn yarenrhag llwytho haearn yn y lleoliad o hemochromatosis etifeddol.
TRAFODAETH
Canfyddiad pwysicaf yr astudiaeth bresennol yw bod HAMP mewndarddol yn rheoli ail-amsugno haearn trwy gyfrwng FPN. Roedd astudiaethau blaenorol wedi adrodd am reoleiddio FPN gan HAMP alldarddol mewn celloedd arennol diwylliedig, a pherthynas wrthdro rhwng lefelau HAMP a FPN yn yarenyn dilyn achludiad wreter unochrog.12,13 Fodd bynnag, dyma'r arddangosiad cyntaf bod rheoliad o'r fath yn gweithredu in vivo o dan amodau ffisiolegol arferol, ac mewn modd sy'n amharu ar homeostasis haearn arennol a systemig. Un o gryfderau penodol yr astudiaeth hon yw'r defnydd o lygod newydd, a gynhyrchir yn fewnol, i atal colled ymatebol HAMP yn benodol i'r arennau. Mae'r dull hwn yn caniatáu astudio'r echel HAMP / FPN arennol heb effeithiau dryslyd homeostasis haearn systemig wedi'i newid, a welir fel arall mewn modelau anifeiliaid hollbresennol.
Ffigur 4|Mae'r peptid / ferroportin gwrthficrobaidd hepcidin arennol (FPN) yn pennu patrwm gorlwytho haearn meinwe mewn hemochromatosis. (a)Lefelau haearn yn aren, iau, calon a ysgyfaint anifeiliaid Fpnwt/C326Y a rheolyddion Fpnwt/wt yn 3 mis oed. (b) Lefelau haearn yn yaren, yr afu, y galon, a'r ysgyfaint mewn anifeiliaid tebyg i wyllt yn darparu naill ai diet chow rheoli (2{00 rhan fesul miliwn [ppm]) neu ddeiet llawn haearn (5{{4{{). 42}}}}00 ppm) rhag diddyfnu am 3 mis. (c) Delweddau cynrychioliadol o staen haearn Perls wedi'i wella â diaminobenzidine (DAB) yng nghortecs arennol ac iau anifeiliaid Fpnwt/C326Y a rheolyddion Fpnwt/wt yn 3 mis oed. Bar ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol10. (d) Darparodd delweddau cynrychioliadol o staen haearn Perls wedi'i wella gan DAB yn y cortecs arennol ac iau anifeiliaid gwyllt naill ai ddeiet chow rheoli (200 ppm) neu ddeiet llawn haearn (5000 ppm) o ddiddyfnu am 3 mis. Bar ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol 10. (d) Cymhariaeth o faint o haearn sy'n llwytho meinwe rhwng anifeiliaid Fpnwt/C326Y ac anifeiliaid gwyllt sy'n cael eu bwydo â diet llawn haearn. Mae'r gwerthoedd a ddangosir ar gyfer pob anifail yn cael eu normaleiddio i gymedr y grŵp rheoli priodol. (f) Delweddau cynrychioliadol o staenio imiwnfflworoleuol FPN yng nghortecs arennol anifeiliaid Fpnwt/C326Y a rheolyddion Fpnwt/wt yn 3 mis oed. Panel uchaf, barrau ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol 10. Panel gwaelod, bar ¼ 25 mm, chwyddwydr gwreiddiol 60. (g) Darparodd delweddau cynrychioliadol o staenio imiwnfflworoleuol FPN yng nghortecs arennol anifeiliaid gwyllt naill ai ddeiet rheoli cow (200). ppm) neu ddeiet llawn haearn (5000 ppm) o ddiddyfnu am 3 mis. Panel uchaf, barrau ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol 10. Panel gwaelod, bar ¼ 25 mm, chwyddhad gwreiddiol 60. Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" a="" ****p="">< 0.0001.="" i="" wneud="" y="" gorau="" o'r="" ddelwedd="" hon,="" gweler="" y="" fersiwn="" ar-lein="" o'r="" erthygl="" hon="" yn="">
Ail ganfyddiad pwysig yr astudiaeth bresennol yw bod yr HAMP/FPN arennol yn pennu maint gorlwytho haearn arennol a systemig (Ffigur 5). Yn wir, roedd colli ymatebolrwydd HAMP mewn tiwbiau arennol yn cynyddu maint gorlwytho haearn yr afu, y ddueg, y galon a'r ysgyfaint, tra'n lleihau maint gorlwytho haearn arennol yn dilyn darparu diet llawn haearn. Yn gyson â hyn, gwelwyd mwy o orlwytho haearn arennol yn dilyn darparu diet llawn haearn i anifeiliaid tebyg i wyllt (lle mae'r echel HAMP/FPN arennol yn gyfan) nag mewn llygod hemochromatosis (lle mae'r echel HAMP/FPN arennol hefyd. tarfu) (haniaeth graffigol). Gallai'r canfyddiad hwn esbonio'r arsylwi clinigol bod yarennid yw'n cael ei effeithio'n gyffredin mewn cleifion â hemochromatosis etifeddol.19
Ffigur 5|Rôl yr echelin peptid gwrthficrobaidd hepcidin arennol (HAMP) / ferroportin (FPN) wrth osod gorlwytho haearn.Mae darparu diet wedi'i lwytho â haearn yn cynyddu argaeledd haearn serwm a lefelau haearn yn y ffifiltrad glomerwlaidd ac yn cynyddu cynhyrchiant hepcidin (HAMP) a rhyddhau gan yr afu. Mae mwy o serwm HAMP yn atal ail-amsugno haearn trwy rwystro FPN mewn tiwbiau arennol. Mae atal adamsugniad haearn yn achosi cadw haearn arennol tra'n lleihau argaeledd haearn systemig ac o ganlyniad yn lleihau gorlwytho haearn yr afu. Mewn llygod FpnC3326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ, mae colli ymatebolrwydd HAMP yn y tiwbiau arennol yn achosi adamsugniad haearn heb ei reoleiddio. Mae hyn, yn ei dro, yn atal cadw haearn arennol tra'n cynyddu argaeledd haearn systemig ac o ganlyniad yn cynyddu gorlwytho haearn yr afu.
Er bod hemochromatosis a gorlwytho haearn dietegol wedi cynyddu FPN mewn tiwbiau arennol, roedd yn ymddangos eu bod yn arwain at wahanol batrymau o leoleiddio i'r adrannau apical, mewngellol, neu fasochrol. Gwnaed arsylwadau tebyg yn y dwodenwm llygod mawr, lle canfuwyd bod gavage haearn yn newid dosbarthiad cymharol FPN rhwng yr adrannau hyn mewn enterocytes dwodenol.20 Un dehongliad o'r canlyniadau hyn yw, wrth osod gorlwytho haearn dietegol, bod mwy o gyfieithu FPN (wedi'i gyfryngu gan proteinau rheoleiddio haearn) yn gweithredu i gynnal cynhyrchiant FPN cyffredinol uchel yn y gell tiwbaidd arennol, tra byddai mwy o HAMP serwm yn lleihau cyfran yr FPN a all leoleiddio i'r bilen fasochrol. Mae’n dilyn o’r dehongliad hwn y gallai’r gwahaniaeth rhwng adroddiadau blaenorol ynghylch lleoleiddio FPN mewn tiwbiau procsimol adlewyrchu gwahaniaethau mewn cynnwys haearn tiwbaidd arennol ac mewn lefelau serum hepcidin rhwng modelau anifeiliaid a ddefnyddiwyd mewn gwahanol astudiaethau.5,11–14,21 Fel arall, gallai'r gwahaniaeth hwn adlewyrchu rhywfaint o adweithedd amhenodol a adroddwyd yn flaenorol mewn perthynas â gwrthgyrff FPN masnachol, gan gynnwys yr un a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth bresennol.14 Mae arwyddocâd swyddogaethol lleoleiddio apical FPN mewn tiwbiau arennol yn parhau i fod yn aneglur, ac ni allem ganfod unrhyw newidiadau mewn ysgarthiad haearn wrinol mewn llygod wedi'u llwytho â haearn (Ffigur Atodol 5C). Sylw diddorol arall yw bod rhywfaint o FPN yn ymddangos yn lleol i'r cnewyllyn mewn tiwbiau arennol o lygod llawn haearn. Gwnaed arsylwadau tebyg gan eraill mewn macroffagau llawn haearn ac yn yr afu llygod mawr. Canfu'r astudiaeth olaf fod FPN niwclear yn ymwneud â chadw haearn niwclear fel rhan o'r ymateb cyfnod acíwt.22,23 Mae angen astudiaethau manwl o leoleiddio isgellog FPN mewn gwahanol daleithiau haearn ac mewn gwahanol batholegau er mwyn datblygu ein dealltwriaeth o'r rôl ymhellach. o FPN yn yr aren.
Nid yw rheoleiddio a swyddogaeth HAMP arennol hefyd yn cael eu deall yn llwyr. Canfuom fod mynegiant y genyn hamp yn yr aren wedi'i gynyddu mewn anifeiliaid tebyg i wyllt ar ôl darparu diet llawn haearn (Ffigur Atodol 5E), ond nid oedd wedi newid o hyd mewn llygod hemochromatosis (Ffigur Atodol 5D), ac yn y rhai sy'n cadw tiwbyn arennol - colli FPN neu diwbyn arennol yn benodol - colli ymatebolrwydd HAMP yn benodol (Ffigur Atodol S5F a G). Nid yw'r canlyniadau hyn yn cefnogi'r syniad bod mynegiant genynnau hambwrdd arennol yn cael ei reoleiddio'n lleol gan lefelau haearn arennol. O ran swyddogaeth HAMP arennol, awgrymodd astudiaeth flaenorol mewn model o achludiad wreter unochrog ei fod yn ymwneud â rheoli FPN arennol. Gwelsom fod HAMP arennol (a ganfuwyd gan ddefnyddio gwrthgorff yn erbyn peptid pro-HAMP) wedi'i gydleoli â calbindin (marcwr tiwbiau troellog distal a dwythellau casglu cortigol a dwythellau cysylltu) (Ffigur Atodol S5H). Ar y llaw arall, nid yw mynegiant FPN yn cydleoli â calbindin, hyd yn oed mewn llygod sy'n cynnal colled arennol-benodol o ymatebolrwydd HAMP (Ffigur 1a a Ffigur Atodol S5I). Nid yw'r canlyniadau hyn yn gyson â rôl awtocrin ar gyfer HAMP arennol wrth reoleiddio FPN arennol. Serch hynny, efallai y bydd HAMP arennol yn ymwneud â rheoleiddio paracrine o FPN arennol. Yn y dyfodol, byddai'n ddiddorol astudio swyddogaethau paracrine HAMP arennol, a meintioli cyfraniadau cymharol HAMP arennol a hepatig i reoli adamsugno haearn.
Sylw diddorol arall o'r astudiaeth bresennol yw, o dan amodau argaeledd haearn arferol, nad yw'r echel HAMP / FPN arennol yn hanfodol ar gyfer cynnal cartrefostasis haearn systemig arferol ac yn hytrach mae'n bwysicach ar gyfer rheoleiddio lefelau haearn arennol, o leiaf mewn llygod benywaidd o y straen C57BL/6. Yn wir, er bod y newidiadau a welwyd mewn lefelau haearn arennol o ganlyniad i golli FPN neu ymatebolrwydd HAMP yn y tiwbiau arennol yn barhaus, roedd newidiadau mewn mynegeion haearn systemig yn dros dro eu natur. Mae natur fyrhoedlog yr effeithiau systemig yn awgrymu'r mecanwaith(au) digolledu cyfranogiad. Un mecanwaith cydadferol posibl yw modiwleiddio amsugno haearn dietegol gan HAMP hepatig. Yn wir, canfuom mewn llygod a oedd yn cynnal colled arennol benodol o ymatebolrwydd HAMP, bod mynegiant genynnau hamp hepatig wedi cynyddu yn dilyn y cynnydd mewn lefelau haearn serwm ar 1-y mis, ac roedd yn dal i gynyddu ar adegau diweddarach. I'r gwrthwyneb, cafodd mynegiant genynnau hamp hepatig ei atal mewn llygod lle collwyd FPN yn benodol ar gyfer yr arennau yn dilyn y gostyngiad mewn lefelau haearn serwm ar y 1-pwynt amser mis ac arhosodd wedi'i atal ar adegau diweddarach (Ffigur Atodol S6A a B). Yn ogystal, roedd cynnydd mewn mynegiant genynnau hambwrdd hepatig yn y lleoliad cyntaf yn cyd-fynd â lefelau FPN perfedd gostyngol, tra bod mynegiant genynnau hambwrdd hepatig gostyngol yn yr ail leoliad yn cyd-fynd â FPN perfedd uwch (Ffigur Atodol S6C a D). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod gweithred HAMP hepatig ar amsugno haearn dietegol yn fecanwaith cydadferol gweithredol sy'n ymwneud â chynnal cartrefostasis haearn systemig arferol yn wyneb adamsugniad haearn arennol cythryblus.
Gall Cistanche atgyweirio swyddogaeth yr arennau
O bwys, o dan amodau argaeledd haearn arferol, mae'n ymddangos bod yr echel HAMP/FPN arennol yn bwysicach mewn llygod benywaidd nag mewn llygod gwrywaidd, o leiaf yn y straen C57BL/6. Ni ellid priodoli'r sylw hwn i wahaniaethau rhwng gwrywod a benywod yng ngweithgaredd y Pax8.CreERT2þ transgene. Mae dimorphism rhywiol yn lefelau a phatrymau cludwyr ar hyd y neffron wedi'i adrodd yn flaenorol yn y straen llygoden hwn.24 Yn gyson â hyn, canfuwyd mynegiant gwaelodol uwch o FPN yn yarennauo fenywod nag yn yr arennau o sbwriel dynion (Ffigur Atodol S2D). Nododd astudiaeth flaenorol gan ddefnyddio gwahanol Cre recombinase transgene, a ysgogwyd gan hyrwyddwr Nestin sy'n weithredol yn gyfansoddiadol i ddileu fpn yn y nephron cyfan, hefyd gynnydd mewn lefelau haearn arennol a gostyngiad mewn haearn serwm a storfeydd haearn yr afu. Fodd bynnag, cynhaliwyd yr astudiaeth honno mewn straen llygoden gwahanol (129/SvEvTac) ac ni ddadansoddodd y ffenoteip yn ôl rhyw neu gwrs amser.14
hemochromatosis ac anhwylderau haearn eraill.
DATGUDDIAD
Ni ddatganodd yr holl awduron unrhyw fuddiannau cystadleuol.
DIOLCHIADAU
Derbyniodd SL-L Gymrodoriaeth Ôl-ddoethurol Canolradd Gwyddoniaeth Sylfaenol Sefydliad Prydeinig y Galon (FS/12/63/29895). Ariannwyd GM gan aProsiect Kidney Research UKgrant (RP_020_20160303) wedi'i ddyfarnu i SL-L.
CYFRANIADAU AWDUR
Astudiaeth wedi'i llunio gan SL-L. Cynhaliodd SL-L a GM arbrofion. Roedd SL-L yn dadansoddi a dehongli canlyniadau. Ysgrifennodd SL-L lawysgrif. Cyfrannodd AC ddeunyddiau. Gwnaeth PAR sylwadau ar y llawysgrif.
DEUNYDD ATODOL
Ffeil Atodol (PDF)
Ffigur S1. Cadarnhad o fanyleb gwrthgyrff FPN a HAMP. (A) Delweddau cynrychioliadol o staenio imiwn fflwroleuol FPN yng nghortecs arennol anifeiliaid Fpnflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ a rheolyddion Fpnflfl/flfl yn 3 mis oed. Paneli uchaf, bar ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol 10. Paneli is, bar ¼ 25 mm, chwyddwydr gwreiddiol 60. (B) Delweddau cynrychioliadol o staenio imiwn-fflworoleuol HAMP yng nghortecs arennol anifeiliaid Hamp–/- a rheolyddion math gwyllt yn 3 misoedd oed. Paneli uchaf, bar ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol 10. Paneli is, bar ¼ 25 mm, chwyddwydr gwreiddiol 60.
Ffigur S2. Cadarnhad o weithgaredd a manylder Pax8.CreERT2þ. (A) Genoteipio llygod Fpnflfl/flfl a Fpnflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ gan ddefnyddio DNA genomig wedi'i dynnu o'r afu, y ddueg, aarenar 1 wythnos ar ôl ymsefydlu tamoxifen. (B) Blot gorllewinol ar gyfer FPN ynarennauo reolaethau FpnC326Yflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd, Pax8.CreERT2þ llygod a FpnC326Y 3 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. Mesur dwysedd y signal a ddangosir yn y panel gwaelod. (C) Blot gorllewinol ar gyfer FPN yn arennau llygod Fpnflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ a rheolyddion Fpnflfl/flfl 3 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. Mesur dwysedd y signal a ddangosir yn y panel gwaelod. (D) Blot gorllewinol ar gyfer Hysbysiad Cosb Benodedig mewn arennau o fenywod gwyllt-fath a gwrywod sbwriel yn 3 mis oed. Mesur dwysedd y signal a ddangosir yn y panel gwaelod. (E–G) Fersiynau mwy o baneli yn Ffigur 1a, g, ac e, yn y drefn honno. Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig. *P < 0.05,="" ***p=""><>
Ffigur S3. Nid yw lefelau serwm erythroferrone yn cael eu newid mewn llygod FpnC326Yflfl/flfl Pax8.CreERT2þ a Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2. (A) Lefelau serwm erythroferrone mewn merched a gwrywaidd FpnC326Yflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ llygod a FpnC326Yflfl/flfl rheolaethau ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. (B) Lefelau serwm erythroferrone mewn merched a gwrywaidd Fpnflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ rheolaethau llygod a Fpnflfl/flfl ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl ymsefydlu tamoxifen. Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig.
Ffigur S4. Nid yw lefelau hemoglobin a serwm erythroferrone yn cael eu newid yn FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ bwydo diet llawn haearn. (A) Lefelau haemoglobin mewn merched a dynion FpnC326Yflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ llygod a rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl yn bwydo naill ai diet rheoli (yn cynnwys haearn 200 ppm) neu ddiet llawn haearn (yn cynnwys 5000 ppm ar gyfer haearn)3 o fisoedd diddyfnu . (B) Lefelau serwm erythroferrone mewn merched a gwrywaidd FpnC326Yflfl/ flfl , Pax8.CreERT2þ llygod a rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl bwydo naill ai diet rheoli (yn cynnwys haearn 200 ppm) neu andiet llawn haearn(yn cynnwys haearn 5000 ppm) rhag diddyfnu am 3 mis. Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig. (C,D) Fersiynau mwy o baneli yn Ffigur 3h ac i, yn y drefn honno.
Ffigur S5. Trin haearn arennol a mynegiant hambwrdd arennol yn y gwahanol fodelau llygoden. (A) Lefelau haearn arennol mewn anifeiliaid Fpnwt/C326Y a rheolyddion Fpnwt/wt yn 6 mis oed. (B) Roedd delweddau cynrychioliadol o staenio imiwnfflworoleuol FPN ac AQP1 yng nghortecs arennol anifeiliaid Fpnflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ a rheolyddion Fpnflfl/flfl yn bwydo diet llawn haearn yn cynnwys 5{000 ppm o ddiddyfnu am 3 mis. Bar ¼ 25 mm, chwyddhad gwreiddiol 60. (C) Roedd lefelau haearn wrinol (wedi'i normaleiddio i creatinin wrinol) mewn anifeiliaid math gwyllt yn bwydo diet llawn haearn yn cynnwys haearn 5000 ppm neu ddiet rheoli yn cynnwys 200 ppm haearn rhag diddyfnu am 3 mis. (D) Mynegiant genynnau hambwrdd arennol mewn anifeiliaid Fpnwt/C326Y a rheolyddion Fpnwt/wt yn 3 mis oed. (E) Roedd mynegiant genynnau hambwrdd arennol mewn anifeiliaid tebyg i wyllt yn bwydo diet llawn haearn yn cynnwys 5000 ppm haearn neu ddeiet rheoli yn cynnwys 200 ppm haearn rhag diddyfnu am 3 mis. (F) Mae mynegiant genynnau hambwrdd arennol mewn llygod FpnC326Yflflflfl, Pax8.CreERT2þ a FpnC326Yflflflfl benywaidd a gwrywaidd yn rheoli ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. (G) Mynegiant genynnau hambwrdd arennol mewn llygod Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ a rheolaethau Fpnflfl/flfl benywaidd a gwrywaidd ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl sefydlu tamoxifen. (H) Delweddau cynrychioliadol o staenio imiwn-fflworoleuol HAMP a CalD yng nghortecs arennol anifeiliaid gwyllt yn 3 mis oed. Bar ¼ 25 mm, chwyddhad gwreiddiol 60. (I) Delweddau cynrychioliadol o staenio imiwnffl-fflworoleuol FPN a CalD yng nghortecs arennol anifeiliaid FpnC326Yflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ yn 1 mis oed. Bar ¼ 25 mm, chwyddhad gwreiddiol 60. (J–M) Fersiynau mwy o baneli yn Ffigur 4c, d, f, ac g, yn y drefn honno. Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig. *P <>
Ffigur S6. Mae mynegiant genynnau hambenni'r afu a lefelau FPN perfedd yn cael eu newid mewn llygod gyda thwbyn arennol-benodol yn cael ei daro allan o fpn ac mewn llygod â chanlyniad tiwbyn arennol penodol o fpnC326Y. (A) Mynegiant cymharol o hamp mRNA yn iau merched FpnC326Yflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ llygod a FpnC326Yflfl/flfl rheolaethau ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. (B) Mynegiant cymharol o hamp mRNA yn iau llygod Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ a rheolyddion Fpnflfl/flfl ar 1 wythnos, 1 mis, 3 mis, a 6 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. (C) Delweddau cynrychioliadol o imiwnedd FPN ym mherfedd llygod FpnC326Y flflflfl, Pax8.CreERT2þ a rheolyddion FpnC326Yflfl/flfl 1 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. Bar ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol10. (D) Delweddau cynrychioliadol o imiwnedd FPN ym mherfedd llygod Fpnflflfl, Pax8.CreERT2þ a rheolyddion Fpnflfl/flfl 1 mis ar ôl triniaeth tamoxifen. Bar ¼ 200 mm, chwyddhad gwreiddiol 10. Dangosir gwerthoedd fel SEM cymedrig. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" a=""><>
Gall Cistanche leddfu haint yr arennau
CYFEIRIADAU
1. Donovan A, Lima CA, Pinkus JL, et al. Mae'r allforiwr haearn ferroportin/slc40a1 yn hanfodol ar gyfer homeostasis haearn. Cell Metab. 2005; 1: 191-200.
2. Ganz T. Haearn cellog: ferroportin yw'r unig ffordd allan. Cell Metab. 2005; 1: 155-157.
3. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Mae Hepcidin yn rheoleiddio efflwcs haearn cellog trwy rwymo i ferroportin a chymell ei fewnoli. Gwyddoniaeth. 2004; 306: 2090-2093.
4. Qiao B, Sugianto P, Fung E, et al. Mae endocytosis a achosir gan hepcidin o ferroportin yn dibynnu ar hollbresennol ferroportin. Cell Metab. 2012; 15: 918-924.
5. Wareing M, Ferguson CJ, Green R, et al. Nodweddu in vivo trafnidiaeth haearn arennol yn y llygoden fawr anesthetized. J Physiol. 2000; 524:581-586.
6. Christensen I, Birn H, Storm T, et al. Derbynyddion endocytig yn y tiwbyn procsimol arennol. Ffisioleg. 2012; 27:223-236.
7. Zhang D, Meyron-Holtz E, Rouault T. metaboledd haearn arennol: trosglwyddo haearn cyflenwi a rôl proteinau rheoleiddio haearn. J Am Soc Nephrol. 2007; 18:401–406.
8. Canonne-Hergaux F, Gruenheid S, Ponka P, Gros P. Lleoli cellog ac isgellog y cludwr haearn Nramp2 yn ffin brwsh berfeddol a rheoleiddio gan haearn dietegol. Gwaed. 1999;93:4406–4417.
9. Wang C, Jenkitkasemwong S, Duarte S, et al. Mae ZIP8 yn gludwr haearn a sinc y mae ei fynegiant arwyneb celloedd yn cael ei uwch-reoleiddio gan lwytho haearn cellog. J Biol Chem. 2012; 287: 34032-34043.
10. Martines A, Masereeuw R, Tjalsma H, et al. Metaboledd haearn yn pathogenesis anaf i'r arennau a achosir gan haearn. Nat Parch Nephrol. 2013; 9:385–398.
11. Wolff N, Liu W, Fenton R, et al. Mynegir Ferroportin 1 yn fasochrol mewn celloedd tiwbyn procsimol arennau llygod mawr ac mae gormodedd o haearn yn cynyddu ei fasnachu pilen. J Cell Mol Med. 2011; 15: 209-219.
12. Pan S, Qian ZM, Cui S, et al. Cynyddodd hepcidin lleol orlwytho haearn mewngellol trwy ddiraddio ferroportin yn yr aren. Biochem Biophys Res Commun. 2020; 522: 322-327.
13. Moulouel B, Houamel D, Delaby C, et al. Mae Hepcidin yn rheoleiddio trin haearn mewnreenol yn y neffron distal. Arennau Int. 2013; 84:756-766.
14. Wang X, Zheng X, Zhang J, et al. Swyddogaethau ffisiolegol ferroportin wrth reoleiddio ailgylchu haearn arennol ac anaf acíwt i'r arennau isgemig. Am J Physol Arennol Physiol. 2018; 315:F1042–F1057.
15. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Chung YJ, et al. Rôl ymreolaethol celloedd hanfodol ar gyfer hepcidin mewn homeostasis haearn cardiaidd. Elife. 2016;5: e19804.
16. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Carr CA, et al. Mae ferroportin cardiaidd yn rheoleiddio homeostasis haearn cellog ac mae'n bwysig ar gyfer swyddogaeth y galon. Proc Natl Acad Sci US A. 2015;112:3164–3169.
17. Espana-Agusti J, Zou X, Wong K, et al. Cynhyrchu a nodweddu llinell drawsgenig Pax8-CreERT2 a llinell ergyd i mewn Slc22a6-CreERT2 ar gyfer trin genetig anwythol a phenodol o gelloedd epithelial tiwbaidd arennol. PLoS Un. 2016;11:e0148055.
18. Lakhal-Littleton S, Crosby A, Frize M, et al. Mae diffyg haearn mewngellol mewn celloedd cyhyrau llyfn rhydwelïol pwlmonaidd yn achosi gorbwysedd rhydwelïol ysgyfeiniol mewn llygod. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116:13122–13130.
19. Camaschella C. Deall homeostasis haearn trwy ddadansoddiad genetig o hemochromatosis ac anhwylderau cysylltiedig. Gwaed. 2005;106:3710–3717.
20. Núñez MT, Tapia V, Rojas A, et al. Mae cyflenwad haearn yn pennu dosbarthiad pilen apigol/ basochrol cludwyr haearn berfeddol DMT1 a fferroportin 1. Am J Cell Physiol Physiol. 2010; 298:C477–C485.
21. Veuthey T, D'Anna MC, Roque ME. Rôl yr aren mewn cartrefostasis haearn: mynegiant arennol o prohepcdin, ferroportin, a DMT1 mewn llygod anemig. Am J Physol Arennol Physiol. 2008; 295:F1213–F1221.
22. Naz N, Malik I, Sheikh N, et al. Mae Ferroportin-1 yn brotein acutephase "niwclear"-negyddol mewn afu llygod mawr: cymhariaeth â phroteinau trafnidiaeth haearn eraill. Buddsoddiad Lab. 2012; 92: 842-856.
23. Aydemir F, Jenkitkasemwong S, Gulec S, Knutson MD. Mae llwytho haearn yn cynyddu lefelau RNA niwclear heterogenaidd ferroportin a mRNA mewn macroffagau murine J774. J Nutr. 2009; 139:434-438.
24. Veiras LC, Girardi ACC, Curry J, et al. Patrwm dimorffig rhywiol cludwyr arennol a homeostasis electrolyte. J Am Soc Nephrol. 2017;28:3504–3517.