Mae KLRG1 yn Marcio Is-setiau Cell CD4 T sy'n ymdreiddio i Tiwmor sy'n Gysylltiedig â Dilyniant Tiwmor Ac Ymateb Imiwnotherapi

Haniaethol

Mae'r dulliau presennol ar gyfer darganfod biofarcwr ac adnabod targedau mewn imiwn-oncoleg yn dibynnu ar gipluniau sefydlog o imiwnedd tiwmor. Er mwyn nodweddu'n drylwyr natur amserol ymatebion imiwn gwrth-tiwmor, fe wnaethom ddatblygu 34-banel cytometreg llif sbectrol paramedr a chynnal dadansoddiadau trwybwn uchel mewn cyd-destunau critigol.

Fe wnaethon ni drosoli dau fodel rhag-glinigol gwahanol sy'n ail-ddangos imiwnoolygu canser (NPKC1) ac ymateb blocâd pwynt gwirio imiwnedd (ICB) (MC38), yn y drefn honno, a phroffilio meinweoedd perthnasol lluosog ar ac o gwmpas pwyntiau ffurfdro allweddol gwyliadwriaeth imiwnedd a dianc a / neu ymateb ICB.

Mae targedau'n cyfeirio at fiomoleciwlau pwysig mewn celloedd, fel proteinau, ensymau a derbynyddion. Cydnabod targed yw'r defnydd o ddulliau cemegol a biolegol i nodi priodweddau a swyddogaethau penodol y biomoleciwlau hyn i'w cymhwyso wrth drin clefydau a datblygu cyffuriau.

Mae imiwnedd yn cyfeirio at allu'r corff i wrthsefyll goresgyniad pathogenau tramor a thwf celloedd annormal mewndarddol. Craidd y system imiwnedd yw celloedd imiwnedd a moleciwlau, sydd â chysylltiadau a rhyngweithiadau agos â'u targedau.

Wrth drin clefydau a datblygu cyffuriau, mae'r berthynas rhwng adnabod targed ac imiwnedd yn bwysig iawn. Er enghraifft, mae mecanwaith gweithredu llawer o gyffuriau trwy adnabod targed, gan dargedu proteinau penodol, ensymau, derbynyddion, a moleciwlau eraill, gan effeithio ar eu swyddogaethau, a rheoleiddio trawsgludiad signal, i gyflawni effeithiau therapiwtig. Gall celloedd a moleciwlau yn y system imiwnedd hefyd fod yn dargedau cyffuriau. Er enghraifft, mae cyffuriau gwrth-ganser yn cyflawni effeithiau therapiwtig trwy effeithio ar ymateb imiwn celloedd canser a rheoleiddio apoptosis celloedd ac ymlediad.

Felly, wrth ddatblygu cyffuriau a thriniaeth glinigol, gall ystyriaeth gynhwysfawr o ffactorau adnabod targed ac imiwnedd arwain at ddatblygiad cyffuriau mwy effeithiol a gwell effaith therapiwtig. O'r safbwynt hwn, mae angen inni wella imiwnedd. Gall cistanche wella imiwnedd. Mae Cistanche yn gyfoethog mewn amrywiaeth o sylweddau gwrthocsidiol, megis fitamin C, fitamin C, carotenoidau, ac ati. Gall y cynhwysion hyn chwilota am radicalau rhydd, lleihau straen ocsideiddiol, a gwella imiwnedd. ymwrthedd system.

Cliciwch cistanche tubulosa echdynnu powdr

Datgelodd dadansoddiad data a yrrir gan ddysgu peiriannau batrwm o fynegiant KLRG1 a nododd yn unigryw boblogaethau celloedd CD4 T sy’n effeithio mewn tiwmor sy’n cysylltu’n gyfansoddiadol â baich tiwmor ar draws modelau tiwmor, ac sy’n cael eu colli mewn tiwmorau sy’n cael atchweliad mewn ymateb i ICB. Yn yr un modd, roedd Helios-KLRG1 ynghyd ag is-set o gelloedd T rheoleiddiol tiwmor (Tregs) yn gysylltiedig â dilyniant tiwmor o gydbwysedd imiwnedd i ddianc ac fe'i collwyd hefyd mewn tiwmorau a ymatebodd i ICB.

Cadarnhaodd astudiaethau dilysu lofnodion KLRG1 mewn celloedd CD4 T sy'n ymdreiddio i tiwmor dynol sy'n gysylltiedig â dilyniant afiechyd mewn canser arennol. Mae'r canfyddiadau hyn yn enwebu poblogaethau celloedd T KLRG1 ynghyd â CD4 fel is-setiau ar gyfer ymchwiliad pellach mewn imiwnedd canser ac yn dangos defnyddioldeb proffilio llif sbectrol hydredol fel peiriant biomarcwr deinamig a / neu ddarganfyddiad targed.

Rhagymadrodd

Mae imiwnotherapi bellach yn biler o driniaeth canser. Fodd bynnag, mae ymatebion i'r rhan fwyaf o gyfryngau imiwnotherapiwtig yn parhau i fod yn brin, wedi'u cyfyngu i nifer gyfyngedig o fathau o diwmor, ac yn anodd eu rhagweld(1). Mae gwella cyfraddau ymateb a datblygu biofarcwyr sy'n rhagfynegi ymateb yn nodau canolog ym maes imiwnoleg tiwmor, ond mae hyn yn parhau i fod yn heriol.

Gall llu o ryngweithiadau amlgellog cymhleth reoli canlyniad ymateb imiwn gwrth-tiwmor mewn unrhyw glaf penodol. Felly, mae'n gyffredin bod biofarcwyr sengl - neu fodiwleiddio therapiwtig o lwybrau unigol - yn dueddol o fod yn ddefnyddiol mewn rhai cleifion canser, ond nid y mwyafrif.

Er enghraifft, mae tri biomarcwr sy'n gysylltiedig ag imiwn yn cael eu defnyddio'n glinigol eang ar hyn o bryd; (i) baich treiglo tiwmor (TMB), fel y'i mesurir yn uniongyrchol neu'n cael ei gasglu trwy bresenoldeb treigladau analluogi mewn peiriannau atgyweirio DNA (2-4), (ii) mynegiant PD-L1 gan imiwn-histochemistry (IHC)(5), a (iii) imiwnedd sy'n bodoli eisoes fel y'i mesurir gan bresenoldeb celloedd T CD8 o fewn ac o amgylch tiwmorau, a elwir yn Immunoscore (6).

Er bod pob un yn gysylltiedig yn sylweddol ag ymateb i imiwnotherapi mewn rhai cyd-destunau, mae sensitifrwydd a phenodoldeb y rhagfynegyddion hyn yn parhau i fod yn is-optimaidd(7). Mae'r dulliau unimodal hyn yn debygol o fethu â dal yn llawn y mecanweithiau cymhleth sy'n sail i imiwnedd gwrth-tiwmor, gan gynnwys natur ddeinamig ymatebion o'r fath sy'n digwydd ar draws meinweoedd a thros amser.

O'r herwydd, gall cymhwyso dulliau proffilio imiwn un cell amlblecs iawn i ganfod biofarcwr a darganfod targedau mewn modd traws-meinwe, hydredol ddarparu mwy o ddefnyddioldeb rhagfynegol a throsiadol i ffenoteipiau imiwnedd cynnil.

I'r perwyl hwn, rydym wedi datblygu 34-banel cytometreg llif sbectrol paramedr a phiblinell dadansoddi data dimensiwn uchel i archwilio ffenoteipiau imiwnedd lefel protein sy'n gysylltiedig â gwahanol gamau o'r cylch imiwnoolygu canser, gan gynnwys dianc imiwn ac alldyfiant tiwmor, a man gwirio imiwnedd ymateb blocâd (ICB) ar draws modelau rhag-glinigol.

Gwnaethom broffilio'r modelau MC38 a driniwyd gan NPK-C1 ac ICB, gan ddadansoddi meinweoedd lluosog (tiwmor, draenio yn erbyn nodau lymff nad ydynt yn draenio, a gwaed) dros ac o amgylch pwyntiau ffurfdro allweddol mewn dilyniant tiwmor. Hwylusodd hyn nodweddiad dwfn y ddeinameg sy'n sail i atchweliad tiwmor naturiol ac a achosir gan ICB, y trawsnewidiad i gydbwysedd imiwnedd, a'r trawsnewidiad dilynol o gydbwysedd i ddihangfa tiwmor heb ei reoli. Cadarnhaodd astudiaethau dilysu mewn setiau data un-gell dynol o ganser arennol berthnasedd trosiadol y canfyddiadau hyn.

Defnyddiau a Dulliau

Llygod. Prynwyd llygod C57BL/6J gwrywaidd a benywaidd (5-6 wythnos oed) o Labordy Jackson (Bar Harbour, ME). Roedd llygod yn 6-8 wythnos oed ar adeg eu defnyddio. Roedd pob anifail yn cael ei gadw dan do yn unol â rheoliadau NIH a Chymdeithas Gofal Anifeiliaid Labordy America. Cymeradwywyd yr holl arbrofion a gweithdrefnau ar gyfer yr astudiaeth hon gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Canolfan Feddygol Prifysgol Columbia (IACUC).

Llinellau Cell. Darparwyd llinell gell NPK-C1 (LM7304 yn wreiddiol) gan Dr. Cory AbateShen ym Mhrifysgol Columbia. Gweler y cyfeiriadau blaenorol am fanylion pellach(8,9). Cynhaliwyd celloedd NPK-C1 yn R10, sy'n cynnwys cyfrwng RPMI (Corning; Corning, NY) wedi'i ategu â 10 y cant FBS (HyClone; Logan, UT), penisilin 100 U / mL, a streptomycin 100 mg / ml (Gibco; Gaithersburg, MD). Prynwyd celloedd carcinoma colon MC38 o Kerafast a'u meithrin yn D10 yn cynnwys DMEM (Corning; Corning, NY) wedi'i ategu â 10 y cant FBS, penisilin 100 U / ml, a streptomycin 100 mg / ml (Gibco; Gaithersburg, MD).

Her Tiwmor a Phigiadau Therapi. Cynaeafwyd celloedd NPK-C1 ar gydlifiad 70-90 y cant neu gelloedd MC38 ar 50-75 y cant o gydlifiad â 0.05 y cant trypsin (Gibco, Gaithersburg, MD), wedi'u golchi â PBS, ei gyfrif, a'i ailddarparu ar gelloedd 10x106/ml mewn PBS oerfel iâ. Ar ddiwrnod 0, mewnblannwyd 6-8 llygod wythnos oed ar yr ochr dde gyda chelloedd 1x106 NPK-C1 neu MC38. Cofnodwyd mesuriadau tiwmor mewn dimensiynau X, Y, a Z (diamedr mwyaf, diamedr lleiaf, ac uchder mwyaf, yn y drefn honno) bob 2-3 diwrnod â chaliper digidol a chyfrifwyd cyfaint tiwmor trwy luosi X * Y * Z. Gwanhawyd gwrth-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) neu wrthgorff isotype Rat IgG2a (Bio X Cell; Libanus, NH) mewn PBS di-haint a'i roi gan chwistrelliad mewnperitoneol (IP) am 200 ug/ mL fesul llygoden ar ddiwrnodau 3, 6, 9, a 12 mewnblaniadau ôl-MC38.

Cynaeafu Meinwe. Yn dilyn ewthanasia’r llygoden, cafodd ~2{1}}0 ul gwaed ei ynysu trwy dyllu’r galon gan ddefnyddio nodwydd chwistrell wedi’i gorchuddio â heparin 0.2 y cant (StemCell Technologies; Vancouver, BC) a’i rhoi ar rew mewn tiwbiau a oedd yn cynnwys 10 ul 0.5M EDTA (Corning; Corning, NY). Cafodd nodau lymff inguinal sy'n draenio tiwmor a heb fod yn draenio eu dyrannu a'u gosod mewn 48-blatiau ffynnon yn cynnwys cyfrwng 150 ul R10 ar iâ.

Cafodd tiwmorau eu cynaeafu, eu màs, a chafodd hyd at 50 mg o diwmor ei deisio a'i roi yn X-Vivo 15 media (Lonza; Basel, y Swistir) mewn tiwbiau Eppendorf 5mL ar rew. Ychwanegwyd DNase (40 ul o hydoddiant 20 mg/mL; Roche; Basel, y Swistir) a Collagenase D (125 ul o doddiant 40 mg/mL; Roche; Basel, y Swistir) at samplau tiwmor cyn eu deor ar siglwr ar 37o C ar gyfer 30 munud. Cafodd adweithiau treuliad eu diffodd trwy vortexing (30 eiliad) ac ychwanegu cyfrwng 5mL R10. Cafodd crynhoadau tiwmor eu hidlo trwy hidlwyr 70 μm (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) a'u pelenni. Cafodd samplau gwaed eu gorchuddio gan RBC gyda dau ddeoriad o 2-munud olynol mewn byffer ACK 2mL (Ansawdd Biolegol; Gaithersburg, MD) a diffodd yn R10 cyn pelenni. Cafodd nodau lymff eu dadgyfuno'n ffisegol â phlymiwr chwistrell 1mL yn y 48-plât ffynnon, yna cafodd ataliadau eu hidlo trwy 40-hidlwyr um. Rhoddwyd yr holl samplau mewn platiau ffynnon 96-gwaelod U ar gyfer eu staenio.

Cytometreg llif. Cafodd samplau eu golchi â PBS. Cafodd celloedd marw eu staenio gan ailddechrau mewn 100 ul PBS ynghyd â llifyn glas y gellir ei osod yn fyw/marw (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Perfformiwyd hyn a phob cam staenio neu sefydlogi pellach am 30 munud ar dymheredd ystafell ar ysgydwr plât, wedi'i amddiffyn rhag golau. Golchwyd samplau 2x gyda PBS, yna fe'u hailddarlledwyd yn FACS (PBS ynghyd â 3 y cant FBS ynghyd â EDTA 1mM ynghyd â 10mM HEPES) wedi'i ategu â TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) a Trustain Monocyte Blocker (1:20; BioLegend; San Diego, CA) a'i roi ar rew.

Paratowyd gwrthgyrff arwyneb ar y gwanhadau gorau posibl (gweler Tabl Atodol S1) yn FACS wedi'i ategu â byffer Brilliant Stain Plus (BD; Franklin Lakes, NJ), yna cawsant eu hychwanegu at samplau mewn datrysiad blocio. Ar ôl staenio, golchwyd samplau 2x gyda byffer FACS a'u gosod mewn 100 ul o glustogiad Kit Gosodiad / Athreiddo FoxP3 (eBioscience; San Diego, CA). Golchwyd samplau ddwywaith gyda byffer Permeabilization 1X (1X PW) ac yna eu staenio mewn 1X PW ynghyd â gwrthgyrff mewngellol. Yna golchwyd samplau ddwywaith mewn 1X PW ac yna eu gosod mewn 100 ul o glustog FluoroFix (BioLegend: San Diego, CA), eu golchi ddwywaith gyda FACS, yna eu hailddarparu yn 200 ul FACS a'u selio yn y platiau ffynnon 96 i'w caffael y diwrnod canlynol ar a Cytek Aurora 5-cytomedr laser.

Defnyddiwyd samplau splenocyte wedi'u staenio ar yr un pryd ar gyfer rheolyddion staen sengl. Dadansoddiad ac Ystadegau. Cynhaliwyd arbrofion proffilio hydredol unwaith yr un ar gyfer modelau MC38 a NPK-C1. Gwerthuswyd cyfanswm o n=10-25 o lygod fesul pwynt amser. Dadansoddwyd data cytometreg llif yn FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ), a lawrlwythwyd algorithmau ategion dimensiwn uchel UMAP a FlowSOM o FlowJo Exchange. Roedd hyd at 30k o CD45 byw ynghyd â chelloedd ymdreiddio tiwmor a hyd at 15k byw CD45 ynghyd â gwaed neu gelloedd sy'n deillio o LN fesul sampl wedi'u cydgadwynu ar gyfer dadansoddiad dimensiwn uchel.

Perfformiwyd yr holl leihau maint a chlystyru yn FlowJo. Perfformiwyd dadansoddiadau ystadegol yn GraphPad Prism v9.3.1. Defnyddiwyd Pearson Correlation i gynhyrchu cyfernodau cydberthynas, a defnyddiwyd profion T Myfyrwyr heb eu paru â chywiriad Welch i gymharu amleddau clwstwr rhwng grwpiau. Disgrifir dulliau dadansoddol ungell yn flaenorol(10,11).

Tynnwyd y regulon KLRG1 o'r metaVIPER KLRG1 regulon consensws o Obradovic, et al(11). I gyfrifo'r llofnod regulon KLRG1, rydym yn gosod model atchweliad coedwig ar hap gyda genynnau regulons fel nodweddion a KLRG1 fel targed, yna cyfrifo sgoriau pwysigrwydd Gini o enynnau regulon i bennu eu heffaith ar fynegiant KLRG1. Rhoddwyd sgôr regulon KLRG1 pob cell gan swm pwysol mesurau mynegiant yr holl enynnau regulon yn y gell gyda sgoriau pwysigrwydd fel pwysau.

For more information:1950477648nn@gmail.com