Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaada, Blaise Robin3, Joeille Perez', Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine', Lea Guyonnet', Helene Lazareth', Emmanuel Letavernier, Carole Henique', Pierre-Louis Tharaux' ac Olivia Lenoir'

'Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Ffrainc; ac Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Paris, Ffrainc

Mae gwerth rhagfynegol cryf proteinwria mewn glomerwlopathïau cronig wedi'i sefydlu'n gadarn yn ogystal â rôl pathogenig angiotensin ll hyrwyddo dilyniant clefyd glomerwlaidd gyda rhwystr hidlo glomerwlaidd wedi'i newid, anaf podocyt a chreithiau glomerwli. Yma canfuom fod angiotensin cronig gorbwysedd Il-achosir yn atal fflwcs awtophagi mewn glomerwli llygoden. Arweiniodd dileu Atg5 (genyn sy'n amgodio protein sy'n cynnwys awtoffagi) yn benodol yn y podocyte at bodosytopathau carlam a achosir gan angiotensin I, albwminwria dwys, a glomerwlosclerosis. Mae hyn yn dangos bod autophagy yn fecanwaith amddiffynnol allweddol yn y podocyte yn y cyflwr hwn. Mae gweithgaredd calpain a achosir gan Angiotensin-Il mewn podocytau yn atal fflwcs awtophagi. Roedd podocytau o lygod gyda mynegiant trawsgenig o'r atalydd calpain mewndarddol, calpastatin, yn arddangos awtoffagi podocyt uwch ar y gwaelodlin a oedd yn gallu gwrthsefyll ataliad angiotensin Il-ddibynnol. Hefyd, awtophagi parhaus gyda calpastatin yn cyfyngu ar ddifrod podocyte ac albwminwria. Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu bod gorbwysedd yn cael effeithiau pathogenig ar adeiledd a swyddogaeth glomerwlaidd, yn rhannol trwy actifadu calpainau sy'n arwain at rwystr o awtophagi podocyt. Mae'r canfyddiadau hyn yn datgelu mecanwaith gwreiddiol lle mae gorbwysedd angiotensin Il-mediated yn atal awtoffagi trwy recriwtio calpain a achosir gan galsiwm gyda chanlyniadau pathogenig rhag ofn y bydd anghydbwysedd gan weithgaredd calpastatin. Felly, gall atal gostyngiad ar sail cyfalafin mewn awtoffagi fod yn strategaeth therapiwtig newydd addawol ar gyfer neffropathi sy'n gysylltiedig â gweithgaredd system renin-angiotensin uchel.

Cistanchedeserticola atalarenclefyd

Datganiad Trosiadol

O ystyried rôl hanfodol awtophagi yn natblygiadarenafiechydon, gallai modiwleiddio ffarmacolegol awtoffagi fod yn strategaeth addawol ar gyfer atal a thrin nifer o glefydau'r arennau. Ochr yn ochr â hyn, canfuwyd bod gor-actifadu gweithgaredd calpain mewn podocytau yn cael effaith andwyol ar weithrediad podocyte tra na nodwyd ei fecanweithiau gweithredu niweidiol. Yma, rydym yn darparu tystiolaeth bod calpain yn cysylltu gweithred niweidiol angiotensin Il â'r rhwystr niweidiol o awtophagi mewn podocytau ac yn awgrymu y gallai ataliad calpain fod yn darged therapiwtig addawol ar gyfer clefydau podocyte yn rhannol trwy gynnal awtophagy podocyte.

Mae gorbwysedd yn ail yn unig i ddiabetes fel prif achos cynyddolcronigarenclefyd-a hyd yn oed cynnydd cymedrol mewn pwysedd gwaed yn ffactor risg annibynnol ar gyfer cam olaf clefyd yr arennau. Mae nifer cynyddol o astudiaethau arbrofol wedi amlygu pwysigrwydd podocytau yn natblygiad podocytauarenanaf. Mae colled cynyddol o podocytes a newidiadau microfasgwlaidd yn ymddangos yn gynnar gyda dirywiad swyddogaethol yr arennau mewn neffropathi hypertensive arbrofol. Mewn cleifion, dangoswyd bod ysgarthiad wrinol o podocytau hyfyw yn farciwr sensitif a phenodol ar gyfer preeclampsia, ac roedd gan gleifion â nephrosclerosis ddwysedd sylweddol is o bodosytau glomerwlaidd na rhoddwyr arennau. At hynny, mae rôl pathogenig angiotensin II (Angel) wrth hyrwyddo dilyniant clefyd glomerwlaidd wedi'i hen sefydlu, nid yn unig mewn amodau gorbwysedd ond hefyd mewn sawl clefyd glomerwlaidd.

Mae gorbwysedd glomerwlaidd yn arwain at ymestyn capilari glomerwlaidd, difrod endothelaidd, a hidlo protein glomerwlaidd uchel gan achosi cwymp glomerwlaidd a glomerwlosclerosis. Mae hefyd yn gweithredu'n uniongyrchol ar strwythurau glomerwlaidd, gan achosi ymatebion rheoleiddio signalau sydd â'r nod o wneud iawn. Mae system renin-angiotensin-aldosterone systemig wedi'i actifadu (RAAS) yn meithrin hyperplasia mesangial a synthesis o ffactorau athreiddedd fasgwlaidd. Ar yr un pryd, mae podocytau yn dangos signalau calsiwm ac yn addasu eu siâp ar dderbynnydd math 1 AnglI (AT1)-28Mae'r mecanweithiau ymaddasol hyn yn dibynnu ar ysgogiad.{5}} yn dod yn gamaddasol yn y tymor hir, gan arwain at glomerwlosclerosis yn y pen draw. Mae AT1 yn cyfryngu cyfranogiad amlwg RAAS ar gyfer pwysedd gwaed a homeostasis halen a dŵr. Defnyddir atalyddion ensymau trosi angiotensin ac atalyddion AT1 yn glinigol ar gyfer trin pwysedd gwaed uchel a methiant y galon mewn cleifion. Yn ddiddorol, mae'r ddau atalydd hefyd yn dangos effaith amddiffynnol ararenswyddogaeth.

Dangoswyd awtophagi i fod yn hanfodol ar gyfer cynnal homeostasis cellog, yn enwedig mewn postmitotic ac yn arbennig mewn podocytes.1- System ddiraddio sy'n gysylltiedig â cll9olysosomaidd ar gyfer proteinau cytoplasmig hirhoedlog ac organynnau camweithredol yw awtophagy55 ac mae'n cynnwys atafaelu proteinau ac organynnau mewn autophagosomau. Mae ffurfio awtoffagosomau yn dibynnu ar sefydlu nifer o enynnau gan gynnwys Mapllc3a/b, Berlin 1, ac Atgs. Mae tystiolaeth gynyddol bod dadreoleiddio'r llwybr awtoffagig yn gysylltiedig â phathogenesisarenheneiddio a sawlarenafiechydon fel anaf acíwt i'r arennau, clefyd yr arennau amlsystig, heneiddio, a neffropathi diabetig.

Nid yw rheoleiddio awtoffagi mewn podocytes, ffisiolegol ac, yn anad dim, mewn cyd-destun patholegol, yn hysbys iawn. Yn ddiweddar, gwnaethom ddangos bod awtophagy podocyte yn annibynnol ar y targed mecanistig o reoleiddio rapamycin (mTOR) mewn cyflyrau ffisiolegol, gan wneud y math hwn o gell yn eithriad. Mae actifadu AT1 yn ysgogi synthesis protein a throsiant protein mewn celloedd. Felly, gwnaethom resymu y gallai actifadu'r RAAS hefyd ddylanwadu ar ysgogi trosiant protein a phroteostasis.

Yn yr astudiaeth bresennol, fe wnaethom ganolbwyntio ar rôl signalau AnglI mewn rheoleiddio awtophagi podocyte. Nodwyd y proteasau calsiwm calpains sy'n cyfryngu effaith blocio cronig AnglI ar awtophagi podocyt. Ymhellach, canfuom fod yr atalydd calpain mewndarddol, calpastatin, yn gallu atal ataliad awtoffagi sy'n ddibynnol ar AngI ac anaf podocyte yn ystod gorbwysedd.

Mae'r canfyddiadau hyn yn datgelu mecanwaith gwreiddiol lle mae gorbwysedd cyfryngol AnglI yn atal awtoffagi trwy recriwtio calpain a achosir gan galsiwm gyda chanlyniadau pathogenig rhag ofn y bydd anghydbwysedd gan weithgaredd calpastatin.

DULLIAU

Anifeiliaid

Darparwyd llygod calpastatin transgenic (CST18) yn garedig gan Dr. E. Letavernier. Cynhyrchwyd llygod ag amhariad podocyt-benodol o'r Atg5) fel y disgrifiwyd yn flaenorol genyn (Nphs2.cre Atg5'o) trwy groesi llygod Nphs2.cre gydag Ag5lxlomice5 ar gefndir C57BL6/J. Nphs2.cre Atg5'oxlox llygod a rheoli gwrywod sbwriel , rhwng 10 i 12 wythnos oed, yn yr astudiaeth hon.Cafodd y model gorbwysedd ei achosi gan infusion sc o AnglI(Sigma-Aldrich, A9525) ar ddogn o 1 ug/kg/mun am 4 i 6 wythnos drwy Pympiau mini osmotig (Alzet Corp, model 2006) Mewnblannwyd pympiau yn sgon y cefn rhwng y llafnau ysgwydd a'r cluniau Roedd llygod yn derbyn ychwanegiad halen (3 y cant NaCl) mewn bwyd.Defnyddiwyd llygod Atgsloxilox (math gwyllt [WT]) fel rheolaethau mewn Ar gyfer halen asetad deoxycorticosterone (DOCA) gyda'r model lleihau neffron, cafodd llygod gwrywaidd sy'n oedolion neffrectomi chwith unochrog Pythefnos ar ôl neffrectomi, cawsant belenni DOCA gyda'r 21-rhyddhau diwrnod (Innovative Research of America)sc Mewnblannwyd ail belen 3 wythnos ar ôl y mewnblaniad cyntaf wedi derbyn 0.9 y cant NaCl mewn dŵr yfed ad libitum a'u lladd ar ôl 6 wythnos o weinyddu DOC.6 Cynhaliwyd arbrofion yn unol â chanllawiau milfeddygol Ffrainc a'r rhai a luniwyd gan y Gymuned Ewropeaidd ar gyfer defnydd anifeiliaid arbrofol (L358-86/609EEC) ac fe'u cymeradwywyd gan Weinyddiaeth Ymchwil Ffrainc a phwyllgor moeseg ymchwil prifysgolion lleol (APAFIS-7646 a -22373).

Arbrawf meithrin podocyt cynradd

Cafodd podocytau cynradd gwahaniaethol eu meithrin fel y disgrifiwyd yn flaenorol./Yn gryno, cafodd y cortecs arennol newydd ei hynysu ei gymysgu a'i dreulio gan golagenase I(Gibco, {{0}}) yn Sefydliad Coffa Roswell Park 1640(Life Technologies,{{2) }}). Yna cafodd meinweoedd eu pasio trwy hidlyddion celloedd 70 μm a 40 μm (BD Falcon, 352340 a 352350). Tynnwyd Glomeruli, sy'n cadw at y hidlydd cell 40 um, gyda halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS; Life Technologies, 10010023) ynghyd â 0.5 y cant o albwmin serwm buchol (Eurobio, HALALB07-65) wedi'i chwistrellu dan bwysau ac yna'n cael eu golchi ddwywaith mewn PBS. Platiau glomeruli ffres wedi'u hynysu mewn 6-llestri ffynnon yn Sefydliad Coffa Roswell Park 1640(Gibco,61870036) wedi'u hychwanegu â 10 y cant o serwm llo ffetws ac 1 y cant o benisilin/streptomycin (Life Technologies, 15140122) i ganiatáu i podocytau ymadael â glomerwli. a thyfu. Gwiriwyd cyfoethogiad podocyte gan ddadansoddiad blot y Gorllewin fel o'r blaen (Ffigur Atodol S1). Cafodd podocytes eu meithrin yn absenoldeb neu bresenoldeb bafilomycin Al(100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) am 4 awr. Ar gyfer arbrofion imiwnfflworoleuedd, gosodwyd podocytau cynradd ar 4 label dysgl (Dutcher, 055071). Yna gosodwyd podocytau mewn paraformaldehyd 4 y cant am 10 munud a'u prosesu ar gyfer imiwnfflworoleuedd.

Assay gweithgaredd Calpain

Pennwyd gweithgaredd calpain mewngellol mewn podocytau cynradd, fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Cafodd cyfanswm o 100,{1}} o gelloedd eu meithrin mewn 24-brydau meithrin meinwe iach yn Sefydliad Coffa Roswell Park 1640 wedi'u hategu â serwm llo ffetws o 10 y cant ac 1 y cant o benisilin/streptomycin. Ar ôl y cyfnod meithrin a nodir, disodlwyd y cyfrwng gyda hydoddiant bicarbonad Krebs-Ringer HEPES (KRH) (pH 7.4) yn cynnwys 4 mM CaCl2, gyda neu heb atalydd calpain 10 uM-1, a'i ddeor am 10 munud cyn ychwanegu o swbstrad calpain 50 mM N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-methycoumarin (Sigma-Aldrich, S6510). Ar ôl cyfnod magu 90-munud, pennwyd gweithgaredd cal-poen fel y gwahaniaeth rhwng fflworoleuedd (wedi'i fesur ar gyffro 360 nm a 430 nm allyriadau) gydag atalydd calpain a hebddo-1.

Blot gorllewinol

Cafodd podocytau cynradd eu crafu gydag 80 ul o glustogfa assay radio-imunoprecipitation yn cynnwys ffosffatas ac atalydd proteas. Mesurwyd crynodiad protein gyda Phecyn Assay Protein BCA (Merck Biochemistry, 71285). Cafodd ugain microgram o broteinau eu electrofforesi ar gel rhag-gastiedig Maen Prawf XT (12 y cant Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Trosglwyddwyd proteinau i bilen polyvinylidene defluoride (Thermo Fischer Scientific, 88518). Ar ôl blocio 5 y cant o laeth yn Tris Buffer Saline 0.1 y cant Tween(TBS-T), deorwyd pilenni â gwrth-LC3(1:1000), Cell Signaling Technology, 2575), gwrth-ATG5 polyclonaidd cwningen (1: 2000, Technoleg Signalau Cell, 2630), gwrth-Sequestosome polyclonaidd moch cwta 1(SQSTM1)/P62(1:10,000, PROGEN,GP62), cwningen polyclonaidd gwrth-calpain 1 parth IV(1:1000, Abcam,ab39170) ), cwningen polyclonal gwrth-calpain 2 amino-terfynell diwedd parth I(1:1000, Abcam, ab39165), llygoden monoclonaidd IgG1 gwrth-calpain 4(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), cwningen gwrth-podocin (1:1000, Abcam, ab50339), mochyn cwta gwrth-nephrin (1:500, PROGEN, GP-N2), a gwrth-tiwbwlin monoclonaidd llygod mawr (1:5000, Abcam, ab6160). Ar ôl golchi, deorwyd pilenni â gwrthgorff yn gysylltiedig â rhuddygl poeth (1:2000, Technoleg Signalau Cell, 7074,7076,7077). Perfformiwyd y gwaith o ganfod signalau penodol gan ddefnyddio'r Pecyn Chemiluminescent ECL (Bio-Rad, 170-5070) ar ddyfais LAS 4000 (Fuji). Defnyddiwyd dadansoddiad densitometreg gyda meddalwedd ImageJ (Y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol) ar gyfer meintioli.

Mesuriadau pwysedd gwaed ac asesiadau ffisiolegol

Cofnodwyd pwysedd gwaed systolig llygod gan ddefnyddio'r dull cyff cynffon (Visitech Systems Inc., BP-2000). Cymerwyd deg mesuriad o bob llygoden, ac yna pennwyd gwerth cymedrig. Mesurwyd pwysedd gwaed systolig ar y llinell sylfaen (12 wythnos oed) ac yna'n wythnosol tan ddiwedd y cyfnod triniaeth. Rhoddwyd yr holl lygod mewn cewyll metabolaidd gyda mynediad am ddim i ddŵr ar gyfer casgliad wrin 6-awr. Dadansoddwyd crynodiadau creatinin wrinol a wrea plasma yn sbectroffotometrig trwy ddefnyddio dull lliwimetrig (Olympus, AU400). Mesurwyd ysgarthiad albwmin wrinol gan ddefnyddio assay immunosorbent penodol sy'n gysylltiedig ag ensymau ar gyfer canfod albwmin mewn wrin llygoden yn feintiol (Crystal Chem, 80630).

Histoleg

Cafodd arennau eu cynaeafu a'u gosod mewn 4 y cant o fformalin wedi'i glustogi gan PBS. Cafodd adrannau wedi'u mewnblannu â pharaffin (3-um o drwch) eu staenio gan drichrome Masson i werthuso morffoleg yr arennau. Graddiwyd annormaleddau yn yr arennau ar sail presenoldeb a difrifoldeb annormaleddau cydrannau, gan gynnwys glomerulosclerosis, ehangiad mesangial, atroffi tiwbaidd neu gastiau, a ffibrosis. Gwerthuswyd cyfran y glomerwli sclerotig trwy archwiliad dall o o leiaf 50 glomeruli fesul adran arennau.

Staenio imiwnofflworoleuedd o adrannau'r arennau a podocytau cynradd

Cafodd podocytau cynradd sefydlog eu rhwystro yn albwmin serwm buchol 3 y cant o TBS-T a'u deor dros nos ar 4 gradd gyda gwrthgyrff cynradd moch cwta gwrth-SQSTM1/P62(1:1000, PROGEN, GP-62C) a chwningen gwrth-wyrdd protein fflwroleuol (GFP; 1: 500, Abcam, ab290). Ar ôl rinsiadau TBS-T, gwrthgyrff eilaidd cyfunedig fflworoffor asyn gwrth-gini IgG AF594-gwrthgorff cyfun (Jackson ImmunoResearch,706-585-148)a gwrthgorff cyfun gwrth-gwningen asyn IgG AF488-( Defnyddiwyd Invitrogen, A21206). Cymerwyd delweddau gan ddefnyddio microsgop fflwroleuol Zeiss 2, camera AxioCam HRc, a meddalwedd Axiovision 4.3.

Ar gyfer arennau fformalin-sefydlog paraffin-gwreiddio (FFPE), adrannau (3 um) yn deparaffinized a hydradol ac adalw antigen yn perfformio yn byffer sitrad gwresogi (pH 6). Yna cafodd adrannau eu treiddio â Triton 0.1 y cant (Euromedex) a'u rhwystro yn albwmin serwm buchol TBS-T3 y cant cyn deor gwrthgyrff dros nos ar 4 gradd . Fe wnaethon ni ddefnyddio gwrth-nephrin gafr (1:100, PROGEN, GP-N2), mochyn cwta gwrth-SQSTM1/P62(1:1000, PROGEN, GP-62C), cwningen gwrth-GFP (1:1000, Abcam, ab290), gwrth-Podocalycsin gafr (PODXL; 1:1000, Bio-Techne, AF-1556), a gwrthgorff cwningen gwrth-Wilm 1 (WT1; 1:100, Abcam, ab192). Gwrthgyrff eilaidd oedd Alexa 488- a Alexa 568-gwrthgyrff cyfun o Invitrogen. Cafodd niwclei eu staenio mewn glas gan ddefnyddio Hoechst. Cafodd sleidiau eu gosod gan ddefnyddio cyfrwng mowntio fflwroleuol (Dako, S3023). Cymerwyd ffotomicrograffau gyda photomicrosgop Zeiss Axiophot a meddalwedd Axiovision. Defnyddiwyd meintoliadau lled-atomatig ar Fiji ar gyfer meintioli ardaloedd neffrin-bositif a PODXL ynghyd â mannau fesul adran glomerwlaidd ar o leiaf 30 glomerwli fesul llygoden. Cafodd rhif podocyt ei gyfrif fel nifer y WT1 ynghyd â niwclysau fesul adran glomerwlaidd ar o leiaf 30 glomerwli fesul llygoden.

Gweithdrefn microsgopeg trosglwyddo electron

Gosodwyd darnau bach o'r cortecs arennol (1 mm) mewn gradd EM glutaraldehyde 3 y cant (Gwyddorau Microsgopeg Electron) am 1 i 30 diwrnod a'u golchi deirgwaith mewn PBS. Cafodd samplau eu hôl-osod mewn 1 y cant o osmium te-troxide 0.1 M (Gwyddoniaeth Microsgopeg Electron) mewn 0.1 M PBS(pH 7.4) a'u golchi mewn dŵr. Cafodd samplau eu dadhydradu mewn graddau alcohol a 100 y cant o propylen ocsid (Gwyddoniaeth Microsgopeg Electron). Perfformiwyd ymdreiddiad resin fel a ganlyn: cymysgwch Epikote 812 a propylen ocsid mewn cymhareb o 1:1 am 30 munud ac yna cymysgedd Epikote 812 a propylen ocsid mewn cymhareb o 1:2 ar gyfer tymheredd ystafell dros nos. Mewnosodwyd samplau mewn capsiwlau gelatin 4 mm yn Epikote 812 100 y cant a'u polymeru mewn popty wedi'i gynhesu i 60 gradd C. Torrwyd rhannau ultrathin â ultramicrotome UFC7 (Leica Microsystems GmbH) a'u dyddodi ar rwyll Gilder Grids 200 (Gwyddoniaeth Microsgopeg Electron). Cawsant eu gwrth-staenio â wranyl asetad 7 y cant (Dosbarthiad LFG) a sitrad plwm Reynold (LFG). Archwiliwyd samplau ym microsgop electron trawsyrru JEM1011 (JEOL) gyda chamera CCD Orius SC1000 (Gatan), a weithredir gyda meddalwedd Digi-talMicrograph (Gatan) i'w caffael.

Arae adwaith cadwynol polymeras meintiol

Cafodd glomeruli newydd eu hynysu eu rhewi mewn adweithydd QIAzol Lysis (Qiagen) ar -80 gradd . Cafodd cyfanswm echdynnu RNA gan ddefnyddio'r dull ffenol ei brosesu yn unol ag argymhellion y gwneuthurwr. Cafodd cDNAs eu syntheseiddio gan ddefnyddio'r Pecyn Llinyn Cyntaf RT² (Qiagen, 330401), a pherfformiwyd adwaith cadwyn polymeras amser real (PCR) gan ddefnyddio Array PCR Custom RT²Profiler （ Qiagen, CLAM36771C) gyda RT'SYBR Green qPCR Mastermix(Qiagen, 330502). Roedd y platiau PCR meintiol yn cael eu rhedeg ar feiciwr StepOnePlus Bio-systemau Cymhwysol. Mae pob arae yn cynnwys rheolaeth ansawdd ar gyfer effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro a halogiad DNA genomig. Perfformiwyd dadansoddiad PCR meintiol gan ddefnyddio'r dull 2-△△CT gyda chymorth Canolfan Dadansoddi Data GeneGlobe (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) ac wedi'i fynegi fel y newid plyg Log2 mewn mynegiant genynnau.

Mewn dadansoddiad proteomig silico

Yn silico gwnaed rhagfynegiad o safle holltiad calpain gyda DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD(http://ccd.biocuckoo.org), a CaMPDB (http:// calpain.org/)offer ar-lein. Cafwyd dilyniant protein asid amino llygoden gan Uniprot ( https://www.uniprot.org ). Ailddechreuir y canlyniadau yn Nhablau Atodol S1 ac S2.

Dadansoddiadau ystadegol

Mae pob graff yn cynrychioli gwerthoedd unigol a chymedr ± SEM. Perfformiwyd dadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism, fersiwn 9. Perfformiwyd cymhariaeth rhwng 2 grŵp gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr parametrig pan basiodd samplau brofion normalrwydd Anderson-Darling a D'Agostino a phrawf F ar gyfer amrywiaeth cyfartal. Fel arall, defnyddiwyd prawf Mann-Whitney nad oedd yn baramedrig. Perfformiwyd cymhariaeth rhwng grwpiau lluosog gan ddefnyddio dadansoddiad 1-way neu 2-ffordd o amrywiant ac yna prawf cymharu lluosog â chywiriad Sidak. Gwerthoedd P<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Ffigur 1| Mae Angiotensin I (Angel) ynghyd â gorbwysedd a achosir gan ddeiet halen uchel (HSD) yn atal awtophag glomerwlaidd. (ac)

Imiwnofflworoleuedd Podocalyxin (PODXL; coch) a P62 (gwyrdd) mewn glomeruli (a, a') rhag llygod math gwyllt (WT), (b, B) o lygod WT ar ôl 6 wythnos o Angel ynghyd â HSD, ac (c) o Nphs2.cre llygod Atgsl/ox yn dangos y casgliad o P62 mewn podocytau yn ystod gorbwysedd ac mewn llygod â diffyg ATG sy'n benodol i podocyte. Mae'r pennau saethau'n dynodi P62 ynghyd â dotiau yn WT yn (a'). Cafodd niwclei eu gwrth-staenio â Hoechst (glas). Mae is-rannau ffigur gyda'r cysefin yn dangos chwyddhad uwch. Barrau =50 μm. （d） Mynegir meintioliad cysylltiedig o'r P62 plus fel canran yr ardal glomerwlaidd.n =4 llygod WT a n=5 WT gyda llygod Angel ynghyd â HSD a Nphs2.cre Atgsoxlo. Cyflwynir gwerthoedd fel lleiniau unigol a chymedr ± SEM. Prawf Mann-Whitney:*P= 0.0159.

Angel ynghyd â gorbwysedd uchel o halen a achosir gan ddeiet yn atal awtophag podocyt

Mae podocytau yn cyflwyno lefel uchel o awtophagy in vivo, fel y dangosir gan fynegiant GFP cryf mewn llygod trawsgenig gydag ymasiad GFP i LC3 (llygod GFP-LC3), marciwr allweddol awtoffagy (Ffigur Atodol S2A). Mae autophagy yn broses ddeinamig gyda ffurfiant cyson o awtoffagosomau a diraddio autophagolysosomes. Arweiniodd blocio diraddiad autophagosomal â chloroquine at gronni GFP plus dotiau, gan nodi fflwcs awtoffagic uchel mewn podocytau (Ffigurau Atodol S2A a B). Dangoswyd cadarnhad bod GFP plws dotiau yn awtoffagosomau gan imiwn-fflworoleuedd dwbl ar gyfer GFP a SQSTM1/P62, protein hebryngydd wedi'i ddiraddio gan awtophagi (Ffigur Atodol S2C a D). Unwaith eto, arweiniodd triniaeth cloroquine at grynhoi GFP ynghyd â P62 plus dotiau, gan ddangos fflwcs awtoffagic pwysig mewn podocytau. Yn olaf, cadwyd fflwcs awtoffagic uchel in vitro fel y dangosir gan fynegiant GFP a P62 mewn podocytes cynradd wedi'u hynysu o lygod GFP-LC3 a chroniad cryf o GFP plus a P62 plus dotiau o dan driniaeth bafilomycin Al, rhwystrwr arall o ddiraddiad autophagosomal (Ffigur Atodol S2E- H).

Yna aseswyd gallu gorbwysedd i fodiwleiddio ymatebion awtoffagic podocyte mewn llygod a gafodd eu trwytho ag AngII â diet â llawer o halen (HSD) am 6 wythnos ac mewn rheolaethau nad oeddent yn orbwysedd. Fel y dangosir yn Ffigur l, mae AnglI a HSD wedi achosi croniad P62 mewn glomeruli gyda chrynhoad cryf mewn podocytau, gan awgrymu felly mai Angl plus HSD oedd yn gyfrifol am rwystr awtoffagi podocyte (tir Ffigur). Yn ddiddorol, roedd crynhoad P62 mewn podocytau yn debyg i'r hyn a welwyd mewn llygod â diffyg ar gyfer awtoffagi podocyte (Nphs2.cre Atg5'olox llygod). cwrs amser y clefyd (Ffigur Atodol S3).

Mae dileu Atg5 yn benodol mewn podocytau yn arwain at fwy o albwminwria, colli podocyt, ac anaf glomerwlaidd yn y model Angel plus HSD

Yna fe wnaethom archwilio a yw rhwystr awtoffagy mewn podocytes yn unig (Nphs2.cre Atg5laxlox llygod) yn effeithio ar anaf glomerwlaidd yn y model AnglI ynghyd â HSD. Cadarnhawyd gennym yn gyntaf fod Nphs2. cre Roedd gan Atg5mice bwysedd gwaed normal, gweithrediad arferol yr arennau, a dim briwiau histolegol glomerwlaidd tan 10 mis oed, fel yr adroddwyd yn flaenorol (lox Atg5'cl (WT) a Nphs2.cre Atgslox Ffigur S4).2 Yna, trwythwyd llygod Atg5'cl â AngII gyda HSD am 6 wythnos. Yn bwysig, roedd pwysedd gwaed systolig yn debyg yn y 2 grŵp ar ôl trwyth AnglI yn ystod yr astudiaeth (Ffigur 2a), er efallai na fyddai gan y dull cyff cynffon a ddefnyddir i fesur pwysedd gwaed y gallu i ddatrys gwahaniaethau pwysedd gwaed bach. Cynyddodd trwyth Angl â HSD yn sylweddol gymhareb albwmin-i-creatinin wrinol mewn llygod WT, a chynyddwyd yr effaith hon yn sylweddol ymhellach mewn llygod (Ffigur 2b). Nphs2.cre Hypertensive Atg5lox/lox Nphs2.cre Roedd llygod Atgsoxlox hefyd yn dangos cynnydd sylweddol yn sglerosis glomerwlaidd o'u cymharu â sbwriel WT (Ffigur 2c-e). Mewn cytundeb â'r proteinwria a fesurwyd, roedd castiau proteinaidd ac ymlediad tiwbaidd yn llawer mwy cyffredin mewn llygod â diffyg podocyte yn ATG5 (Ffigur 2f-h).

Gostyngodd nifer y podocytau fesul glomerwlws yn sylweddol yn Nphs2.cre Atg5loxlox (Ffigur 2i-k). Anafiad Podocyte mewn Nphs2.cre Roedd llygod Atgsoxlo gyda thrwyth AngII ynghyd â HSD hyd yn oed yn symud ymlaen i glomerwlosclerosis ffocal a segmentol fel y dangosir gan fynegiant y gell epithelial parietal (PEC). ) marciwr activation CD44 mewn glomeruli (Ffigur 2l ac m). Nododd dadansoddiad microsgopeg electron newidiadau sylweddol yn gysylltiedig â diffyg ATG5 ar drwythiad AngII cronig â HSD, gan gynnwys elifiad prosesau traed mewn…llygod. Mewn cyferbyniad, ychydig o Nphs uwch-gorbwysedd2. cre Atg5'oxlx Canfuwyd diffygion strwythurol mewn podocytes o lygod WT hyd yn oed ar ôl 10 wythnos o drwythiad AngII â HSD (Ffigur 2n ac o), sy'n dangos bod angen gweithgaredd awtoffagig podocytau ar gyfer eu hymwrthedd i Angel ynghyd â difrod a achosir gan HSD. Gyda'i gilydd, roedd ein canlyniadau'n dangos, yn y model AnglIl plus HSD, bod ataliad awtoffagi yn gwaethygu anafiadau a cholled podocyte ac yn achosi glomerwlosclerosis ffocws a chylchrannol dilynol.

Ffigur 2| Mae dileu Atg5 yn benodol mewn podocytau yn arwain at gynnydd sylweddol mewn albwminwria, anaf i'r arennau, a cholli podocyt ar ôl 6 wythnos o drwythiad angiotensin Il(Angel) ynghyd â diet â llawer o halen (HSD). (a) Pwysedd gwaed systolig mewn llygod Atgslo/b a Nphs2.cre Ataslo yn ystod 36 diwrnod o Angel ynghyd â HSD.n =9 llygod fesul genoteip. Cyflwynir gwerthoedd fel cymedr ± SEM. Dadansoddiad dwy ffordd o amrywiant (ANOVA): ns. Mewn (bm), n =10 llygod fesul genoteip. Yn(b,g,h,k), cyflwynir gwerthoedd fel plotiau unigol a chymedr± SEM.(b) Angel plws HSD (parhad

Ffigur 3| Mynegiant calpain a gweithgaredd mewn podocytau.(a) Dadansoddiad echdyniad gorllewinol o fynegiant calpain-1.calpain-2, a calpain-4 mewn podocytau cynradd. Mae mynegiant tubulin yn normaleiddio. (b) Mesurwyd gweithgaredd calpain ar podocytau cynradd a gafodd eu trin neu na chafodd eu trin ag angiotensin ll (Angel; 100 nM) am 24 awr gyda neu heb calpeptin (10 uM), n =5 arbrofion annibynnol. Cyflwynir gwerthoedd fel lleiniau unigol a chymedr ± SEM. Dadansoddiad unffordd o amrywiant (ANOVA): triniaeth, prawf cymharu lluosog P=0.0035.Sidak:*P=0.0128 ar gyfer Angll yn erbyn llinell sylfaen," P=0.0056 ar gyfer Angll plus calpeptin versus Angll.(c) Mesurwyd gweithgaredd calpain ar bodosytau cynradd o lygod tebyg i wyllt (WT) neu calpastatin transgenic (CST') a gafodd eu trin neu heb eu trin ag Angel (100 nM) am 24 awr. n {{18} } arbrofion annibynnol. Cyflwynir gwerthoedd fel plotiau unigol a chymedr ± SEM ANOVA dwy ffordd wedi'i baru ar gyfer genoteip triniaeth. P= 0.0483. Prawf cymhariaeth luosog Sidak:**P=0.0009 ar gyfer WT Angll yn erbyn llinell sylfaen,*P=0.0420 ar gyfer CST'9 Angll yn erbyn llinell sylfaen, *P=0.0424 ar gyfer WT yn erbyn CST9 Angll.

Pls cliciwch yma i Rhan 2