Rhan 1: Mae Cistanoside Of Cistanche Herba yn Lleddfu Difrod Atgenhedlol Gwryw a achosir gan Hypocsia Trwy Atal Straen Ocsidiol
Mar 26, 2022
Cyswllt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Crynodeb:Mae tystiolaeth gynyddol yn dangos bod hypocsia yn achosi anffrwythlondeb gwrywaidd, a gall hypocsia fod yn gysylltiedig â straen ocsideiddiol (OS). Mae Cistanoside (Cis) yn gyfansoddyn glycoside ffenylethanoid y gellir ei dynnu o CistanchesHerba ac mae ganddo swyddogaethau biolegol amrywiol. Nod yr astudiaeth hon oedd ymchwilio i effeithiau amddiffynnol difrod atgenhedlu Cis a achosir gan hypocsia ac archwilio'r mecanweithiau sylfaenol penodol. Lluniwyd modelau arbrofol hypocsia celloedd ac anifeiliaid, ac aseswyd effeithiau amddiffynnol gwahanol isdeipiau o Cis ar y system atgenhedlu gwrywaidd in vitro ac in vivo. Dangosodd y canlyniadau fod hypocsia wedi lleihau hyfywedd celloedd GC-1 yn sylweddol trwy arestiad cylchred celloedd ac actifadu apoptosis, a oedd yn gysylltiedig â mwy o OS.Moreover, dangosodd Cis effeithiau gwrthocsidiol cryf yn vitro ac in vivo, gan adfer gweithgareddau ensymau gwrthocsidiol yn sylweddol a is-reoleiddio lefelau rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) wrth gynyddu hyfywedd celloedd a lleihau apoptosis. Yn bwysig, roedd yr isdeipiau Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C, a Cis-H) a astudiwyd yma i gyd yn dangos rhai effeithiau gwrthocsidiol, ac effeithiau Cis-B oedd y rhai mwyaf arwyddocaol yn eu plith. Mae'r astudiaeth hon yn dangos bod Cis yn gwanhau'n sylweddol effeithiau niweidiol OS a achosir gan hypocsia trwy effeithio ar weithgareddau ensymau gwrthocsidiol mewn ceilliau a chelloedd GC.
Geiriau allweddol: Cistanoside, hypocsia hypobarig, anffrwythlondeb gwrywaidd, straen ocsideiddiol, amddiffyniad atgenhedlu
planhigyn cistanche ffres
Rhagymadrodd
Ar hyn o bryd, mae tua 48.5 miliwn (15 y cant) o gyplau o oedran atgenhedlu ledled y byd yn cael eu heffeithio gan anffrwythlondeb [1], ymhlith y mae 40-50 y cant o'r achosion yn cael eu priodoli i anffrwythlondeb gwrywaidd [2], cyflwr sydd â chysylltiad cryf â'r amgylchedd a ffordd o fyw. ffactorau. Mae tystiolaeth yn awgrymu bod tueddiad y mamaliantestis i bwysedd ocsigen isel yn ffactor achosol rhai mathau o anffrwythlondeb gwrywaidd [3]. Fel y dangoswyd mewn astudiaethau blaenorol, mae sbermatogenesis yn cael ei amharu a'i leihau wrth ddod i gysylltiad â hypocsia hypobarig [4-7].
Er mwyn archwilio'r mecanwaith sylfaenol, mae astudiaethau wedi dangos bod dod i gysylltiad â hypocsia hypobarig yn cynyddu cynhyrchiad rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) [8, 9]. Mae ROS yn chwarae rhan bwysig yn y system atgenhedlu thema. Ar lefelau isel, mae eu hangen ar gyfer cynhwysiant sberm, yr adwaith acrosom, ac ymasiad sbermatosoa-oocyte[10]. Fodd bynnag, gall ROS gormodol achosi difrod DNA sbermniwclear / mitochondrial a difrod perocsidiol pilen plasma, sydd yn ei dro yn ffactorau etiolegol mawr ar gyfer y risg uwch o anffrwythlondeb gwrywaidd [11, 12]. Felly, gallai cronni ROS a achosir gan hypocsia fod yn un o achosion anffrwythlondeb dynion.
Mae Cistanches Herba, planhigyn meddyginiaethol parasitig lluosflwydd, wedi'i ddosbarthu'n eang mewn ardaloedd cras [13] a'i ddefnyddio'n eang oherwydd ei weithgareddau ffarmacolegol [14-17]. Ymhlith holl gynnwys effeithiol Cistanches Herba, mae PhGs wedi cael eu hystyried fel y brif gydran weithredol. Hyd yn hyn, mae 34 PhG wedi'u hynysu o weithfeydd Cistanches [13]. Mae Cistanoside (Cis), PhG anactif wedi'i ynysu o Cistanches Herba, wedi cael sylw am ei effeithiau gwrthocsidiol.
O ystyried effeithiau gwrthocsidiol Cis a rôl ROS mewn anffrwythlondeb gwrywaidd a achosir gan hypocsia, mae Cis yn cael ei ystyried yn ymgeisydd cyffuriau posibl ar gyfer trin maleinffrwythlondeb a achosir gan hypocsia. Fodd bynnag, ychydig o adroddiadau sydd wedi mynd i'r afael ag effeithiau gwrthocsidiol Cis a dynnwyd o Cistanches Herba wrth drin anffrwythlondeb gwrywaidd a achosir gan hypocsia neu'r llwybrau signalau dan sylw. Yn yr astudiaeth hon, lluniwyd modelau arbrofol in vitro ac in vivo hypocsia ac aseswyd cydrannau effeithiau gwahanol Ciswer.
Mae gan Cistanche aeffaith cynhyrchu atgenhedlu.
Defnyddiau a dulliau
Diwylliant celloedd ac adweithydd
Prynwyd y llinell gell sbermatogonia llygoden GC-1spg(GC-1) o'r American TypeCulture Collection (ATCC) a'i meithrin yn DMEM(Invitrogen, UDA) wedi'i hategu â serwm ffetalbovine 10 y cant, 1 y cant L- glutamin (100 mM), penisilin (100 U/mL), a streptomycin (100 ug/mL) ar 37 gradd mewn deorydd llaith gyda 5 y cant o CO2. Prynwyd Cis (Cis-A, B, C, H) o Chengdu Gelipu Biotechnology Co, Ltd (Tsieina).
Assay hyfywedd celloedd
Profwyd hyfywedd celloedd gan becyn cyfrif celloedd{{{0}}assay (CCK-8). Yn gryno, cafodd celloedd GC-1 eu hadosod i 96-blatiau ffynnon ar 1.5×103 y ffynnon a’u meithrin ar 37 gradd am 24 awr. Yna, cafodd y celloedd eu trin â chrynodiadau gwahanol (20 y cant, 15 y cant, 10 y cant, 5 y cant) o ocsigen neu grynodiadau gwahanol (2 μM, 0.2 μM, 0.02 μM) o Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C , Cis-H) am yr amser gofynnol. Yna, cafodd y supernatant ei daflu, a chanfuwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio pecyn CCK-8 (DojindoJapan). Mesurwyd amsugnedd pob ffynnon ar 450 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate (BioRad USA). Yn olaf, cyfrifwyd hyfywedd y gell yn unol â'r fformiwla ganlynol:
Hyfywedd celloedd=(grŵp ODarbrofol - grŵp ODblank)/(grŵp ODcontrol - grŵp ODblank) × 100 y cant .
Dadansoddiad o blotiau gorllewinol
Cafodd celloedd neu feinweoedd wedi'u cynaeafu eu homogeneiddio byffer inRIPA i echdynnu proteinau (RIPA BeyotimeTsieina; Coctel Roche Swistir). Casglwyd supernatants, a phrofwyd y crynodiad o broteinau gan y dull BCA (Beyotime). Cafodd tua 40 ug o'r proteinau a echdynnwyd o bob sampl eu gwahanu gan SDS-PAGE a'u trosglwyddo'n electro i bilen hidlo nitrocellulose (NC) (BeyotimeChina). Cafodd pilenni hidlo NC eu rhwystro â 5 y cant o laeth di-fraster am 1.5 h a'u deor â gwrthgyrff penodol (gwrth-PARP 1:1000, gwrth-Caspas-3 1:1000, gwrth-Bcl-2 1:1000, gwrth-Bax1: 1000, gwrth-GAPDH 1:1000; prynwyd yr holl wrthgyrff o Cell Signaling Technology, UDA) dros nos ar 4 gradd. Yna, cafodd holl bilens y CC eu deor â'r gwrthgorff eilaidd cyfatebol marchruddygl peroxidase-cyfunedig am 1.5 awr ar dymheredd yr ystafell a delweddwyd gyda system ddelweddu (Tannon, Tsieina).
atchwanegiadau dyfyniad cistanche powdr
Canfod cylchred celloedd
Perfformiwyd assay cytometrig llif (FCM) i ddadansoddi'r cylchred celloedd. Cafodd celloedd eu trin o dan amodau gwahanol am 72 h a'u cynaeafu. Yna cafodd y celloedd eu golchi â PBS, eu gosod mewn ethanol 75 y cant, a'u staenio â propidiumiodide (PI). Ar gyfer pob sampl, casglwyd a dadansoddwyd celloedd 1 × 104 yn ôl cytometreg llif (FASCalibur, BD Biosciences). Yna, cyfrifwyd y gyfran o gelloedd cyfnod G1/S/G2 a'r mynegai amlhau [Cam(S plws G2)/Cam (G1 plws S plws G2) × 100 y cant].
Ki-67 staenio
Roedd celloedd yn cael eu meithrin mewn dysgl confocal a'u trin â hypocsia neu wahanol isdeipiau o Cis am72 h. Ar ôl trwsio pob cell â 4 y cant o baraformaldehyd, cawsant eu deor â gwrth-gorff gwrth-Ki (1:200, Technoleg Signalau Cell). Yna, cafodd yr holl gelloedd eu deor â gwrthgorff IgG gwrth-gwningen cyfun cyfatebol CY{-3-(1:200, Boster, China) a datrysiad DAPI (1.0ug/mL, Beyotime). Gwelwyd fflworoleuedd gyda microsgop confocal Fluoview FV1000 (Olympus, Japan).
Canfod ROS
Cyflwynwyd FCM i fesur lefelau ROS mewngellol gan ddefnyddio DCFH-DA. Roedd celloedd crog yn cael eu hadu mewn 6-blatiau ffynnon ac yn destun triniaethau gwahanol. Ar ôl 72 h o driniaeth, ataliwyd celloedd mewn DMEM di-serwm gyda 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Yna penderfynwyd cynnwys ROS gan ddidoli celloedd wedi'i actifadu gan fflworoleuedd ar System Cytometreg Llif Coulter Beckman gyda thonfedd cyffro o 488nm a thonfedd allyriadau o 525 nm [18].
Pennu perocsidiad lipid (LPO)
Perfformiwyd assay sylweddau adweithiol asid thiobarbitwrig (TBARS) i ganfod LPO. Perfformiwyd camau gweithredu yn unol â'r cyfarwyddiadau (Sigma USA). Cyfrifwyd y crynodiadau gan ddefnyddio cyfernod difodiant molar o 1.56×105/(M·cm), a gafwyd gan ddefnyddio malondialdehyde fel safon. Mynegir y canlyniadau fel nmol oMDA cyfwerth/mg o brotein.
Pennu gweithgareddau ensymau
Profwyd y gweithgareddau ensymau gan ddefnyddio citiau assay gan gynnwys glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx), a superoxide dismutase (SOD). Perfformiwyd yr holl gamau gweithredu yn unol â'r cyfarwyddiadau a ddarparwyd (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China).
Anifeiliaid a phrotocol arbrofol
Cafwyd llygod mawr Wistar gwrywaidd aeddfed (180-220 g, 8 w oed) o ganolfan anifeiliaid y Pedwerydd Prifysgol Feddygol Filwrol, Xi'an, Tsieina. Cafwyd caniatâd i ddefnyddio'r anifeiliaid gan Bwyllgor Moeseg y Brifysgol (Rhif cyfeirnod : 20190506). Cynhaliwyd yr arbrawf anifeiliaid yn unol â chanllawiau'r brifysgol ar gyfer gofalu am anifeiliaid labordy a'u defnyddio.
Caniatawyd i bob llygod mawr addasu am tua wythnos cyn dechrau'r arbrawf. Ar ôl ymgynefino, cafodd y llygod mawr eu dosbarthu ar hap i 6 grŵp gyda 5 anifail ym mhob grŵp. Codwyd y llygod mawr yn y grŵp rheoli o dan bwysau arferol (PO2: 20 y cant; pwysedd aer: 101.3 kPa), tra codwyd y llygod mawr yn y model a'r grwpiau Cistreated mewn siambr ocsigen pwysedd isel (pwysedd mewnol o 61.6 kPa, sy'n cyfateb i uchder o 4000 metr uwchlaw lefel y môr; PO2: 14.55 y cant ) i efelychu amgylchedd hypocsig uchder uchel. Roedd gan yr holl lygod mawr fynediad rhydd i fwyd a dŵr mewn cewyll plastig ar 22± 2 gradd a lleithder gyda chylchred golau/tywyll 12-h awtomatig. Arhosodd y llygod mawr yn y model a'r grwpiau a gafodd eu trin â Cis o dan amodau hypobarig ond fe'u trosglwyddwyd amodau tonormobaidd bob 96 awr, pryd y darparwyd bwyd a dŵr iddynt a glanhawyd y cewyll. Hyd y trawsnewid o hypobarig i hypobarig oedd tua 2 h. Cafodd yr holl grwpiau triniaeth eu trin â'r Cis cyfatebol (8 mg/kg/d) trwy gludydd llafar am 8 wythnos, tra bod y llygod mawr rheoli a model yn cael eu trin â chyfaint cyfartal o ddŵr.
Ar ôl 8 wythnos, aberthwyd llygod mawr o dan anesthesia. Roedd ceilliau, epididymis, a fesiglau seminol yn cael eu gwahanu a'u pwyso, a chyfrifwyd mynegai'r organ yn ôl y fformiwla ganlynol: (pwysau pwysau organ/anifail) × 100 y cant . Yn dilyn hynny, casglwyd sberm yn yr epididymis, a phrofwyd eu symudoldeb a'u gweithgaredd acrosomeenzyme. Yn yr un modd, casglwyd meinweoedd ceilliau ar gyfer astudiaethau histopathologic a ROS, LPO, a chanfod ensymau gwrthocsidiol.
Gwerthusiad o gyfradd sberm byw
Roedd yr epididymis wedi'i endorri â siswrn llawfeddygol, a pharatowyd yr ataliad sberm mewn halwynog arferol. I werthuso'r gyfradd sberm byw, cymysgwyd 5 μL o'r ataliad sberm yn ofalus gyda chyfaint cyfartal o eosin-Ystain. Yna cyfrifwyd y sberm dan ficrosgop golau. Aseswyd cyfraddau sberm byw trwy gyfrifo sberm wedi'i staenio (sberm marw) a sberm heb ei staenio (sberm byw).
Powdwr Cistanche tubulosayn cynyddu'rcyfraddau sberm byw.
Am fwy o wybodaeth, cliciwch yma.
Penderfynu ar ensymau acrosom sberm
Defnyddiwyd y profion gweithgaredd ensymau acrosom sberm i werthuso acrosomeenzymes sberm [19]. Cafodd y canlyniadau ym mhob grŵp eu cyfrifo gan ddefnyddio'r fformiwla ganlynol: Gweithgaredd ensymau acrosom (μIU)=(ODExperimentgroup - grŵp ODBlank)/(247.5×10) × 106.
Dadansoddiad ystadegol
Mynegir yr holl ddata meintiol fel y cymedrig± DC a chawsant eu dadansoddi gan ddefnyddio meddalwedd SPSS 22.0. Defnyddiwyd prawf-t Myfyriwr Annibynnol i gymharu'r data rhwng dau grŵp. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
