Rhan Ⅱ:Ynysu Diglycosidau Newydd a Amnewidiwyd o Ffenylpropanoid O Salsa Cistanche A'u Gweithgaredd Ataliol Ar DIM Cynhyrchiad mewn Macrophage wedi'u Harwyddo â Dad-ddyblygu
Mar 04, 2022
Cyswllt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-bost:audrey.hu@wecistanche.com
Awgrymwyd grŵp methylbutenyl 3-, sef is-strwythur aglycone, gan y cydberthyniadau COZY o H-2 â H-1a a H-1b a chydberthynas HMBC rhwng H{{). 4}} a H-5 a'r carbonau olefinic, ar kC 120.7 (C-2) a 136.4 (C-3). Sefydlwyd dwy ran o siwgr gan ddadansoddiad sbectra NMR a dadansoddiad sbectra HPLC o'r hydrolysad asid, gyda phatrwm darnau MS. Penderfynwyd mai'r ffurfweddiad absoliwt ohonynt oedd D-glucose a L-rhamnose gan ddefnyddio dadansoddiad HPLC o'r hydrolysad asid [17]. Diffiniwyd y moieties siwgr hyn fel -glwcos ac a-rhamnose trwy gyplu cysonion y protonau anomerig. Roedd y sbectrwm 1H-1H COZY yn dangos cydberthnasau dilyniannol o H-13 i H-63 ac o H-133 i H-633 (Ffigur 4).
Awgrymodd proton glwcos wedi'i symud i lawr ar kH 4.70 (H-43) amnewidyn acyl ar glwcos. O'r sbectrwm HMBC, cadarnhaodd y gydberthynas rhwng H-43 a C-9333 safle'r amnewidyn caffeoyl. Roedd cydberthnasau HMBC rhwng H-13 a C-1 (kC 64.5) a rhwng H-33 (kH 3.68) a C-133 (kC 101.2) yn awgrymu safleoedd pob eilydd . Yn unol â hynny, pennwyd strwythur 6 fel 3-methylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D- glwcos-pyranosid ac o'r enw cistansalside B.
Penderfynwyd bod Cistansalside C (12), powdr amorffaidd brown, â fformiwla moleciwlaidd o C26H38O13 gan (plws ) -HR-ESI-QTOF-MS, a ddangosodd uchafbwynt ar m/z 581.2213 [M plws Na] plws (calcd .am C26H38O13Na, 581.2205). Awgrymodd ïon nodweddiadol ar m/z 163 fod amnewidyn caffeoyl yn bodoli yn y strwythur. Roedd yr ïonau darn yn m/z 325 a m/z 471 yn awgrymu bodolaeth uned rhamnose ac uned glwcos.
Roedd cymhariaeth o sbectra NMR o 12 â rhai 6 yn dangos eu bod yn debyg heblaw am y strwythur aglycone. Yn y sbectra NMR o 12, arsylwyd dau garbon paraffinic ar kC 38.0 (C-2) a 24.4 (C-3) yn lle dau garbon oleffinig ar kC 12{{16 }}.7 (C-2) a 136.4 (C-3) yn yr aglycone o 6. Symudwyd y grwpiau methyl merminol (kH 0.88) yn yr aglycone o 12 i fyny'r cae perthynol i H-4 a H-5 (kH 1.71 a 1.63) yn yr aglycone o 6 (Tabl 2). Awgrymwyd bod yr aglycone o 12 yn grŵp methyl butyl 3-, a gadarnhawyd gan sbectra 1H a COZY NMR. Gwelwyd uchafbwynt y grŵp methyl butyl 3- ar 3.81 (1H, m, H-1a), 3.48 (1H, m, H-1b), 1.71 (1H, m , H-3), 1.44 (2H, m, H-2), a 0.88 (H-4, 5).
Ailgadarnhawyd dwy elfen siwgr gan ddadansoddiad HPLC o'r hydrolysad asid a'r dadansoddiad sbectra NMR yn ogystal â phatrwm darnau MS. Cafodd cyfluniadau absoliwt y siwgrau eu nodi fel D-glucose a L-rhamnose gan ddefnyddio dadansoddiad HPLC o'r hydrolysad asid [17]. Cadarnhawyd moiety glwcos a moiety a-rhamnose trwy gyplu cysonion y protonau anomerig. Roedd sbectrwm 1H-1H COZY yn dangos cydberthyniadau dilyniannol o H-13 i H-53, o H-133 i H-333, ac o H{{11} } i H-433 (Ffigur 4).
Cadarnhawyd sefyllfa'r dirprwyon trwy ddadansoddiad HMBC. Yn sbectrwm HMBC, mae'r cydberthnasau rhwng H-13 a C-1 (kC 67.2), rhwng H-33 (kH 3.68) a C-133 (kC 101.2) a rhwng Canfuwyd H-43 (kH 4.70) a C-9333 (kC 165.7). O ganlyniad, sefydlwyd strwythur 12 i fod yn 3-methyl butyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)({25}}O-(E)-caffeoyl- -D-glucose-pyranosid a o'r enw cistansalside C.
Roedd Cistansalside D (17), powdr brown amorffaidd, yn benderfynol o gael fformiwla moleciwlaidd o C31H38O14 gan y modd positif ESI-QTOF-MS cydraniad uchel, a ddangosodd uchafbwynt ïon adduct ar m/z 657.2147 [M plws Na] plws (calcd. ar gyfer C31H38O14Na, 657.2154). Ionau darn gan gynnwys [M plws H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] ynghyd ag ïon ar m/z 147, a [M plws H x Aglycone x Rha] ynghyd ag ïon yn m/z 351 ac a [M plws H x Aglycone] ac ïon ar m/z 497 hefyd. Awgrymodd ïon nodweddiadol ar m/z 147 fod amnewidyn coumaroyl yn bresennol yn ei strwythur. Awgrymodd yr ïonau darn yn m/z 351 a m/z 497 fodolaeth uned rhamnose ac uned glwcos wedi'i hamnewid am asetyl.
Cistansalside ollysieuyn cistanche
Datgelodd y sbectrwm 13C-NMR bresenoldeb 31 atom carbon. Arsylwyd dau broton anomerig ar kH 4.61 (1H, m, H-13) a 4.60 (1H, s, H{{10}}) yn sbectra 1H a HSQC . Roedd y sbectrwm 1H-NMR yn dynodi presenoldeb grŵp methyl ar 1.97 (3H, s, acetyl-CH3), traws-olefin yn kH 7.55 (1H, d, J=15.9 Hz, H{{ 25}}) a 6.34 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8333) a dau gylch bensen para-amnewidiol yn kH 7.53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) a 6.79 (2H, d, J=6.9 Hz, H-2333, 6333)/ kH 6.98 (2H, d, J {{5 0}}.0 Hz, H-2, 6) a 6.65 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) (Tabl 2) . O sbectrwm NMR HMBC, mae'r cydberthynas rhwng carbonyl carbon ar kc 165.5 (C-9333) a H-8333 a rhwng H-2333, 6333, a C-7333 (kc 145.4) yn awgrymu grŵp (E)-coumaroyl. Roedd cydberthynas HMBC rhwng brig methyl proton a charbonyl carbon ar kc 169.0 yn cadarnhau presenoldeb grp asetyl.
Awgrymwyd 4-grŵp hydroxyphenyl yn seiliedig ar gydberthynas HMBC rhwng H-3, 5, a charbonau aromatig cwaternaidd ar kC 155.6 (C-4) a 128.6 (C-1) . Cadarnhawyd grŵp ethyl hydrocsylaidd gan y signalau COZY NMR yn kH 2.66 (2H, t, J=6.1 Hz, H-7), 3.90 (1H, m, H{-8a ) a 3.54 (1H, m, H{-8b). Roedd cydberthynas HMBC rhwng H-7 a C-1 (kC 128.6) a C-2, 6 (kC 129.7) yn awgrymu 4-grŵp hydroxyphenylethyl, fel is-strwythur aglycone.
Cafodd dwy elfen siwgr, a awgrymwyd o batrwm darnau MS, eu hailgadarnhau gan ddadansoddiad HPLC o'r hydrolysad asid a'r sbectra NMR. Eglurwyd D-glucose a L-rhamnose gan ddefnyddio dadansoddiad HPLC o'r hydrolysad asid [17]. Sefydlwyd moiety -glucose a moiety a-rhamnose trwy gyplu cysonion y protonau anomerig. Roedd sbectrwm 1H-1H COZY yn dangos cydberthyniadau dilyniannol o H-13 i H-53 ac o H-133 i H-633 (Ffigur 4).
O'r sbectrwm 1H-NMR, awgrymodd y symudiad i lawr o H-23 (kH 4.69) a H-43 (kH 4.8{0) y safle amnewidiol acyl ar glwcos. Cafodd y cysylltiadau rhwng glwcos a dau grŵp acyl eu cadarnhau gan gydberthynas HMBC rhwng H-43 (kH 4.80) a C-9333 a rhwng H-23 a charbonyl carbon o grŵp asetyl (kC 169.0). ). Rhoddwyd safleoedd aglycone a rhamnose gan gydberthynas HMBC rhwng H-33 (kH 3.95) a C-1333 a rhwng H-8 a C{-13. Yn unol â hynny, neilltuwyd strwythur 17 fel 4-hydroxyphenylethyl-2-O-acetyl-O{- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- couaroyl- -D-glucopyranoside a'r enw cistansalside D.
Cafodd Cistansalside E (18) ei ynysu fel powdr brown amorffaidd. Penderfynwyd mai ei fformiwla foleciwlaidd oedd C31H38O14 gan ddata 13C-NMR a'r uchafbwynt modd positif ESI-QTOF-MS cydraniad uchel ar m/z 657.2166 [M plws Na] plws (calcd. ar gyfer C31H38O14Na, 657.2154). Yn ogystal, canfuwyd hefyd ïonau darnio gan gynnwys ïon caffeoyl ar m/z 163, [M plws H x Aglycone x Rha] ynghyd â ïon yn m/z 367 ac ïon [M plws H x Aglycone] ar m/z 513. Roedd yr ïonau darn yn awgrymu bodolaeth uned rhamnose ac uned glwcos a amnewidiwyd asetyl.
Roedd y sbectrwm 1H-NMR yn awgrymu presenoldeb dau broton anomerig ar kH 4.63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) a 4.60 (1H, s, H-133 ) a dau broton glwcos a amnewidiwyd acyl yn kH 4.71 (1H, dd, J=8.9, 8.2 Hz, H-23) a 4.81 (1H, dd, J=9.7 , 9.5 Hz, H-43). Awgrymodd sbectra 1H a HMBC fodolaeth grŵp asetyl ar kH 1.94 (3H, s, acetyl-CH3), a (E)-caffeoyl moiety ar kH 7.48 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7333), 7.02 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2333), 6.98 (1H, dd, J=8.1, 1.6 Hz, H-6333), 6.76 (1H,d, J=8.1 Hz, H-5333) a 6.21 (1H, d, J=15.9 Hz, H{ {67}}) a chylch bensen mono-amnewidiol yn kH 7.29 (2H, m, H-3, 5), 7.21 (2H, m, H-2, 6) a 7.20 (1H, m, H-4) (Tabl 2). Awgrymwyd grŵp ffenylmethyl, sef is-strwythur aglycone, gan gydberthynas HMBC rhwng H-7 (2H, kH 2.80, m) a C-1 (kC 138.8) a rhwng H-7 a C -2, 6 (kC 128.9) a signalau COZY NMR o H-7 gyda H-8a (1H, kH 3.99, m) a H-8b (1H, kH 3.63, m).
Ailgadarnhawyd dwy elfen siwgr gan ddadansoddiad HPLC o'r dadansoddiad hydrolysad asid a'r dadansoddiad sbectra NMR. Eglurwyd cyfluniadau absoliwt y siwgrau gan ddefnyddio dadansoddiad HPLC o'r hydrolysad asid, a gadarnhawyd i fod yn D-glucose a L-rhamnose [17]. Sefydlwyd moiety -glucose a -rhamnose moiety trwy gyplu cysonion y protonau anomerig. Roedd sbectrwm 1H-1H COZY yn dangos cydberthyniadau dilyniannol o H-13 i H-53, o H-133 i H-233, ac o H{{11} } i H-333 (Ffigur 4).
O sbectrwm HMBC, mae'r cydberthnasau rhwng H{{{{{{{{{{0}} a C-8 (kC 69.4), rhwng H-23 a charbonyl carbon grŵp asetyl (kC 169.1), rhwng Cadarnhaodd H-33 (kH 3.95) a C-133 (kC 102.0) a rhwng H-43 (kH 4.81) a C-9333 (kC 165.6) safle'r eilyddion yn y strwythur. Felly, penderfynwyd bod strwythur 18 yn ffenylethyl-2-O-acetyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranoside a o'r enw cistansalside E.
Cafodd y rhan fwyaf o'r dirprwyon traws-cinnamoyl eu isomereiddio i'r cis-isoform in vitro. Adroddwyd bod golau yn trosi deilliadau asid traws-cinnamig yn cis-isoforms [18,19]. Gwelwyd bod cydbwysedd trawsnewid traws-cis yr eilyddion sinamoyl yn cynnal tua 70 y cant o'r unigion yn y traws-isoform. Ar gyfer protonau olefin y ffurf cis, mae brigau tua 6.90 ppm(d, J=12~13 Hz, H-7333) a 5.80 ppm (d, J=12~13 Hz, Roedd H-8333) yn neilltuo yn y sbectra 1H-NMR, tra bod copaon ar tua 7.55 ppm (d, J=15.8 Hz, H{-7333) a 6.40 ppm (d, J { Arsylwyd {28}}.8 Hz, H-8333)ar gyfer trawsnewid [20]. Yn y sbectrwm 1H-NMR o gymysgeddau traws-cis, arsylwyd brigau ar gyfer dau broton olefinic (H-7333 a H{-8333) yn y gymhareb o 7:3 (trans:cis). Roedd copaon 13C-NMR y ffurf cis yn debyg i rai'r trawsnewid.
Cynhwysion effeithiol o cistanche: acteosides
Profwyd yr holl unigion am eu heffeithiau ataliol ar gynhyrchu NO a achosir gan LPS yn RAW
Profwyd yr holl unigion am eu heffeithiau ataliol ar gynhyrchu NO a achosir gan LPS mewn celloedd RAW 264.7. Defnyddiwyd Dexamethasone fel rheolydd positif a'i IC50 oedd 7.0 uM. O'r cyfansoddion a brofwyd, cyfansoddion 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{{{}). 24}}}} o 4.0 uM) a 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) yn dangos gweithgareddau ataliol cymedrol ar synthase anwythol NO, tra bod y cyfansoddion eraill yn anactif yn y assay hwn (IC50 gwerthoedd > 100 uM). I wirio a oedd gan y cyfansoddion hyn sytowenwyndra, mesurwyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio assay MTT. O ganlyniad, nid oedd yr un ohonynt yn dangos sytowenwyndra arwyddocaol (Ffigur Atodol S6-1). Dewiswyd y pedwar cyfansoddyn hyn i werthuso eu gweithgaredd ataliol yn erbyn y llwybr NF-λB mewn celloedd RAW 264.7 a symbylwyd gan LPS. Arweiniodd symbyliad celloedd RAW 264.7 ag LPS at ffosfforyleiddiad I入B a NF-入B (t65) ar ôl 0.5 awr o ddeori. Cafodd ffosfforyleiddiad NF-入 B (t65) ei leihau'n sylweddol gan ragdriniaeth gyda chyfansoddion 11, 13 a 18 fel y dangosir gan ddadansoddiad blotiau gorllewinol (Ffigur 5). Felly, gallai cyfansoddion 11, 13 a 18 gael effeithiau gwrthlidiol trwy atal NF-入B mewn macroffagau.
Ffigur 5.Effaith pedwar cyfansoddyn ar ffosfforyleiddiad I入B a NF-入B (t65) mewn celloedd RAW 264.7 a symbylir gan LPS. (A) Cynhaliwyd y blotiau gorllewinol mewn LPS a chelloedd RAW 264.7 wedi'u trin â sampl; (B, C) Cafodd y signalau imiwnoblot eu meintioli gan ddefnyddio meddalwedd densitometreg Molecular Analyst/PC (Bio-Rad, Richmond, CA, UDA). Adroddir dadansoddiad densitometrig o isoformau ffosfforyleiddiad. Cafodd NF- 入 B mewn cell RAW 264.7 ei normaleiddio i gynnwys -actin.
3. Defnyddiau a Dulliau
3.1. Arbrawf Cyffredinol Gweithdrefn
Mesurwyd cylchdroadau optegol gyda pholarimedr digidol Jasco P-2000 (Jasco, Tokyo, Japan). Cofnodwyd sbectra UV ar sbectromedr Chirascan a Circular Dichroism (Chirascan, APL, UK). Recordiwyd sbectra IR gan ddefnyddio sbectroffotomedr Jasco FT/IR-4200. Perfformiwyd sbectrometreg màs ïoneiddio electrochwistrellu uchel-amser-hedfan (HR-ESI-qTOF-MS) ar Q-TOF LC/MS Agilent 6530 Cywir-Mass gyda chyfres Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, UDA), a'r golofn a ddefnyddiwyd oedd colofn Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4.6 mm, 5 um). Defnyddiwyd Meddalwedd Gweithfan MassHunter ar gyfer caffael data.
Cafwyd sbectra NMR 1D (1H a 13C) a 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) gyda Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 a Bruker AVANCE 800 sbectromedrau HD ynghyd â cryoprobe (Bruker, Ettlingen, yr Almaen). Defnyddiwyd DMSO-d6 (Labordai Isotop Caergrawnt, Yn Cistanche Andover, MA, UDA) fel toddydd NMR a chopaon cyfeirio (kH 2.50 a kC 39.5). Perfformiwyd cromatograffaeth colofn (CC) gan ddefnyddio Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Sweden) neu gel silica Kieselgel 60 (40–63 um, 230–400 rhwyll, Art. 9385; Merck, Darmstadt) , Yr Almaen). Cynhaliwyd cromatograffaeth haen denau (TLC) ar blatiau gel silica F254 Kieselgel 60 wedi'u gorchuddio ymlaen llaw (Art. 5715; Merck). Canfuwyd smotiau ar TLC gan ddefnyddio lamp UV ar 254 nm a 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Ffrainc). Perfformiwyd cromatograffaeth hylif gwasgedd canolig (MPLC) ar golofn fflach silica RediSep 120 g (Isco, Lincoln, NE, USA) a gel silica Kiesegel 60 (40–63 um, 230–400 rhwyll, Art. 9385; Merck) gan ddefnyddio a Cydymaith Combiflash (Isco). Roedd y system cromatograffaeth hylif pwysedd uchel (HPLC) yn HPLC Gilson wedi'i gyfarparu â phwmp Gilson 321 a synhwyrydd UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, UDA), gan ddefnyddio colofnau ODS lled-baratoi (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, UDA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, yr Almaen; Inno C018 colofn 12 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Roedd y system RP-HPLC ddadansoddol yn system gynghrair Waters 2695 gyda synhwyrydd Photodiode Array (PDA) a996 (Waters Corp, Milford, MA, UDA), a'r golofn a ddefnyddiwyd oedd colofn Hypersil™ BDS C18 (130 Å, id 150: 4.6 mm, 5 um, Thermo Gwyddonol™). Prynwyd asid fformig gan Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, Korea). Prynwyd toddyddion gradd HPLC gan Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Korea). Prynwyd H2SO4, Na2CO3, a thoddyddion gradd gyntaf ar gyfer echdynnu, ffracsiynu ac ynysu oddi wrth Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, Korea). Prynwyd hydroclorid methyl ester L- a D-cystein ac o-tolylisothiocyanate gan Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan).
3.2. Planhigyn Deunydd
Mae planhigion cyfan oCistanche salsa, a gasglwyd o'r Shinjang Uyghur, eu mewnforio trwy Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Korea). Cawsant eu hadnabod gan yr Athro Dr Jehyun Lee (Prifysgol Dongguk, Seoul, Korea). Adneuwyd y sbesimen taleb (SNUPH2016-03) yn Llysieufa Gardd Planhigion Meddyginiaethol, Coleg Fferylliaeth, Prifysgol Genedlaethol Seoul.
3.3. Echdynnu a Ynysu
Mae'r planhigion cyfan sych oCistanche salsa(5.7 kg) eu torri a'u tynnu dair gwaith gyda MeOH (20 L) ar dymheredd ystafell gyda sonication am 99 min. Ar ôl cael gwared ar y toddydd yn waguo, Y dyfyniad crai (1.35 kg) ei atal yn H2O (5 L), yna rhaniad gyda EtOAc (5 L). Gwahanwyd y gweddillion EtOAc (55.3 g) yn 16 ffracsiynau (E01-16) ar gromatograffeg gel silica yn eluting gyda CHCl3/MeOH (50:1–0:1, system graddiant cam).
Roedd E{8}}8 (611.7 mg) yn destun cromatograffaeth hylif gwasgedd canolig gel silica (25 g) ac yn aneglur gyda CHCl3/MeOH (18:1 –0:1, system graddiant cam) a wedi rhoi 11 ffracsiynau (E08a-k). O E08g, purwyd cyfansoddion 13 (0.7 mg) a 18 (0.6 mg) gan ddefnyddio colofn Luna 5 um HPLC ac elution isocratig gyda 28 y cant dyfrol. MeCN. Purifigation HPLC (Hypersil AUR, 25 y cant aq. MeCN) o E08h (138.5 mg) cyfansoddion dodrefnu 7 (10.6 mg), 8 (17.2 mg), 14 (13.4 mg) a 17 (4.9 mg).
Cafodd E{8}}9 (1.15 g) ei buro ymhellach ar golofn silica-MPLC (20 g) eluting gyda CHCl3/MeOH (1{0:1–0:1, cam- system graddiant) i roi 11 subfractions (E09a-k). Roedd E09e (398.7 mg) yn destun Sephadex LH-20 (MeOH) a rhoddodd wyth isffracsiwn (E09e1-8). Wedi hynny purwyd E09e6 gan ddefnyddio colofn HPLC Hypersil GOLD (22 y cant aq. MeCN) i fforddio cyfansawdd 11 (0.4 mg). O E09e7, cafodd cyfansawdd 5 (0.6 mg) ei buro gan deimlad isocrataidd o golofn Luna 5 um HPLC gyda 40 y cant yn dd. MeOH.
Gwahanwyd E10 (1.2{0g) yn naw ffracsiwn (E10ai) ar golofn Sephadex LH-20 yn eluting gyda MeOH. O E10g (147.5 mg), cafodd cyfansoddion 4 (13.4 mg), 9 (8.0 mg) a 15 (5.0 mg) eu hynysu gan wahaniad HPLC (Inno, 23 y cant aq. MeCN). Cafodd ffracsiwn E10h (470.0 mg) ei buro ar golofn Hypersil GOLD trwy elution isocratig (40 y cant aq. MeOH) i gynhyrchu cyfansoddion 1 (3.8 mg), 10 (42.1 mg) a 16 (3.0 mg).
Cafodd E11 (2.96 g) ei ddarostwng i Sephadex LH-20 eluting gyda MeOH i roi naw ffracsiwn (E11a-i). E11e ei wahanu gan Sep-Pak cetris C18 eluting fesul cam gyda 10 y cant , 20 y cant , 30 y cant , 50 y cant a 100 y cant dyfrol . MeOH i gynhyrchu saith ffracsiwn (E11e1-7), ac yna Luna 5 um HPLC (28 y cant aq. MeCN) i roi cyfansoddion 3 (3.4 mg), 6 (1.4 mg) a 12 (1.2 mg).
Roedd E12 (19.0 g) yn destun silica MPLC (120 g) gan ddefnyddio system graddiant cam CHCl3/MeOH i roi chwe ffracsiwn (18:1–{{0:1) , E12a-f). Cafodd E12f ei gromatograffi ar golofn Sephadex LH-20 (MeOH), gan ildio saith ffracsiwn (E12f1-7). HPLC puro (Hypersil GOLD, 25 y cant aq. MeCN) o E12f7 cyfansawdd 2 (3.3 mg). Roedd yr holl doddyddion a ddefnyddiwyd ar gyfer HPLC yn byffer asid fformig 0.05 y cant. Y gyfradd llif cyffredin ar gyfer cromatograffaeth HPLC a MPLC oedd 3 a 40 mL/munud, yn y drefn honno.
3.4.Nodweddiad
Cistansalside A (5): powdr amorffaidd brown; [ |20 x33.7 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3.18); IR (taclus) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; Data 1H-NMR (800 MHz) a 13C-NMR(200 MHz), gweler Tabl 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plws Na] plws 645.2146 (calcd. ar gyfer C30H38O14Na, 645.2154).
Cistansalside B (6): powdr amorffaidd brown; [ |20 x72.9 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3.32); IR (taclus) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; Data 1H-NMR (500 MHz) a 13C-NMR (125 MHz), gweler Tabl 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plws Na] plws 579.2054 (calcd. ar gyfer C26H36O13Na, 579.2048).
Cistansalside C (12): powdr amorffaidd brown; [ |20 x61.6 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3.25); IR (taclus) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; Data 1H-NMR (800 MHz) a 13C-NMR (200 MHz), gweler Tabl 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plws Na] plws 581.2213 (calcd. ar gyfer C26H38O13Na, 581.2205).
Cistansalside D (17): powdr amorffaidd brown; [ |20 x51.1 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3.53), 315 (3.52); IR (taclus) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; Data 1H-NMR(400 MHz) a 13C-NMR (75 MHz), gweler Tabl 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plws Na] plws 657.2147 (calcd. ar gyfer C31H38O14Na, 657.2154).
Cistansalside E (18): powdr amorffaidd brown; [ |20 x59.2 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3.22); IR (taclus) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; Data 1H-NMR (800 MHz) a 13C-NMR(200 MHz), gweler Tabl 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plws Na] plws 657.2166 (calcd. ar gyfer C31H38O14Na, 657.2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Dadansoddi
Perfformiwyd dadansoddiad sbectrometreg màs cromatograffig ar system LC cyfres Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc., USA). Roedd y golofn ddadansoddol yn golofn SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}} : 4.6 mm, 5 um, Jasco, Japan). Roedd y cyfnod symudol yn cynnwys 0.1 y cant (v/v) asid fformig yn MeCN (A) a dŵr (B) gan ddefnyddio elution graddiant o 0–35 munud (23 y cant A), 35–45 munud ( 23-28 y cant A), 45-75 mun (28 y cant A) a 75-80 mun (90 y cant A). Cadwyd y gyfradd llif ar 0.3 mL/munud. Mesurwyd yr amsugnedd ar 320 nm. Roedd amodau'r ffynhonnell ESI fel a ganlyn: cyfradd llif nwy sychu (N2), 10 L/munud; tymheredd nwy sychu, 350 gradd; nebulizer, 30 psig; cyfradd llif nwy gwain, 12.0 L/mun; tymheredd nwy gwain, 350 gradd; capilari, 4000 V; sgimiwr, 60 V; wythpol RF, 750 V; foltedd darniwr, 180 V; modd cadarnhaol. Gweithredwyd y system o dan feddalwedd gweithfan Masshunter. Gosodwyd yr amrediad màs ar m/z 50–1000.
3.6.Asid Hydrolysis
Cafodd cyfansoddion eu hydroleiddio gan ddefnyddio 1 N H2SO4 (100 uL) wedi'i gynhesu â baddon dŵr ar 90 gradd am2 h, yna'i niwtraleiddio â hydoddiant Na2CO3 dyfrllyd dirlawn. Ar ôl i'r atebion gael eu sychu o dan ffrwd o N2, diddymwyd y cynhyrchion a'r siwgrau safonol (D-Glc, L-Glc, L-Rha) mewn pyridine (100 uL) sy'n cynnwys hydroclorid methyl ester L-cysteine (0.5 mg). Diddymwyd sampl L-rhamnose mewn pyridine (100 uL) sy'n cynnwys hydroclorid methyl ester D-cysteine (0.5 mg). Ar ôl hynny, cawsant eu cynhesu ar 60 gradd am 1 h. Cafodd yr atebion eu trin ag 1 uL (1.11 mg) o o-tolylisothiocyanate, a gafodd eu gwresogi eto ar 60 gradd am 1 h. Dadansoddwyd pob cymysgedd terfynol yn uniongyrchol gan RP-HPLC dadansoddol (colofn Hypersil™ BDS C18, 17 y cant aq. MeCN, 0.8 mL/min, 40 mun, 35 gradd). Roedd tR y brig yn 21.9 a 40.4 munud yn cyd-daro â deilliad thiocarbamoyl thiazolidine o D-glucose a L-rhamnose, yn y drefn honno.
3.7. Cell Diwylliant
Cafwyd macroffagau Murine, RAW 264.7, gan Sefydliad Ymchwil Biowyddoniaeth a Biotechnoleg Corea (Daejeon, Korea), a'u tyfu mewn cyfrwng RPMI sy'n cynnwys 10 y cant o serwm buchol ffetws a 100 U/mL penisilin/streptomycin sulfate. Deorwyd celloedd mewn awyrgylch CO2 llaith o 5 y cant ar 37 gradd .
3.8.Cyffuriau a Chemegau
Prynwyd RPMI, penisilin a streptomycin gan HyClone (Logan, UT, UDA). Prynwyd albwmin serwm buchol ac LPS gan Sigma (St. Louis, MO, UDA).
3.9.Mesur DIM Cynhyrchiad
Mesurwyd y crynodiad nitraid yn y cyfrwng diwylliant fel dangosydd o gynhyrchu NO yn ôl adwaith Griess. Cafodd y celloedd eu hadu ar 2:105 cell/wel mewn 96-blatiau meithriniad ffynnon. Ar ôl deori'r celloedd RAW 264.7 am 18 h, cafodd y celloedd eu rhag-drin â chyfansoddion (50 uM, 10 uM, 5 uM, neu 1 uM) a'u hysgogi â LPS (500 ng / mL) am 24 h. Cyfansoddion prawf hydoddi mewn DMSO. Cafodd celloedd eu trin hefyd gyda 0.05 y cant DMSO fel rheolaeth cerbydau. Cafodd celloedd RAW 264.7 (2: 105 o gelloedd/ffynnon) eu meithrin mewn 96-blatiau ffynnon gan ddefnyddio RPMI heb ffenol coch a'u rhag-drin â samplau am 0.5 h. Ysgogwyd cynhyrchu NO cellog trwy ychwanegu LPS crynodiad terfynol 500 ng/mL a deoriad 24 awr. Yn dilyn deori, cymysgwyd 100 uL o gyfryngau cyflyru gyda'r un cyfaint o adweithydd Griess a'i ddeor am 15 munud. Mesurwyd amsugnedd y cymysgedd yn 540 nm gyda darllenydd microplate ELISA (Meincnod, Labordai Bio-Rad, Richmond, CA, UDA). Cymharwyd y gwerthoedd a gafwyd â'r rhai o grynodiadau safonol o sodiwm nitraid wedi'i hydoddi mewn RPMI, a chyfrifwyd y crynodiadau o nitraid yn y cyfryngau cyflyru o gelloedd wedi'u trin â sampl.
3.10.3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Deiphenyltetrazolium Bromid (MTT) Assay for Cell Viability
Cafodd celloedd eu hadu i {{0}}blatiau ffynnon ar ddwysedd o 5:104 cell/ffynnon a'u deor â chyfryngau di-serwm ym mhresenoldeb samplau. Cyfansoddion prawf hydoddi mewn DMSO. Cafodd celloedd eu trin hefyd gyda 0.05 y cant DMSO fel rheolaeth cerbydau. Yn dilyn deori am 24 h, ychwanegwyd 10 uL MTT (5 mg/mL mewn halwynog) a pharhawyd i ddeor am 4 awr arall. Mae dehydrogenase succinate mitocondriaidd mewn celloedd byw yn trosi MTT yn grisialau formazan gweladwy yn ystod y cyfnod magu. Yna cafodd y crisialau formazan eu hydoddi mewn dimethyl sulfoxide a mesurwyd yr amsugnedd ar 540 nm gan ddefnyddio darllenydd microplate assay immunosorbent (ELISA) sy'n gysylltiedig ag ensymau (Meincnod, Labordai Bio-Rad). Cyfrifwyd hyfywedd celloedd cymharol o'i gymharu ag amsugnedd y grŵp rheoli heb ei drin. Perfformiwyd yr holl arbrofion yn driphlyg.
3.11.Dadansoddiad Immunoblot
Aseswyd mynegiant protein trwy blotio gorllewinol yn unol â gweithdrefnau safonol. Yn gryno, cafodd celloedd RAW264.7 eu meithrin mewn dysglau meithrin 6{{20}} mm (2: 1{{{{06/mL), wedi'i ddilyn gan ragdriniaeth o 50 uM o gyfansoddion . Golchwyd celloedd ddwywaith mewn PBS oer iâ (pH 7.4), cafodd y pelenni celloedd eu hailddarlledu mewn byffer lysis ar rew am 15 munud, ac yna tynnwyd y malurion celloedd trwy allgyrchu. Pennwyd crynodiad protein gan ddefnyddio adweithydd assay protein Bio-Rad yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Cymysgwyd protein (20-30 ug) 1:1 gyda 2: byffer sampl (20 y cant glyserol, 4 y cant SDS, 10 y cant 2- ME, 0.05 y cant bromophenol glas, a 1.25 M Tris [pH 6.8]), llwytho ar geliau SDS-TUDALEN 8 neu 15 y cant, ac yn rhedeg ar 150 V am 90 munud. Trosglwyddwyd proteinau cellog i bilenni polyvinylidene diffuoride Immunoblot (Bio-Rad) gan ddefnyddio system drosglwyddo lled-sych Bio-Rad yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yna deorwyd y pilenni dros nos gyda'r gwrthgyrff cynradd p-NF-入B, NF-入B, pI入B a -actin (Abcam, Caergrawnt, y DU) mewn halwynog â chlustogau Tris yn cynnwys 5 y cant o laeth sgim a 0.1 y cant Tween 20. Y diwrnod canlynol, golchwyd y blotiau deirgwaith gyda halwynog wedi'i glustogi gan Tris (0.1 y cant Tween 20) a'u deor am 1 awr gyda gwrthgorff gwrth-IgG eilaidd wedi'i gyfuno â HRP (wedi'i wanhau 1:2{{{{{{{{{{000}})–1) :20,000). Golchwyd y blotiau eto deirgwaith gyda halwynog wedi'i glustogi gan Tris (0.1 y cant Tween 20), a datblygwyd bandiau imiwn-adweithiol gan ddefnyddio'r swbstrad cemiluminescent ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, UDA).
3.12.Dadansoddiad Ystadegol
Cyflwynir data arbrofol fel y cymedr o SEM. Pennwyd lefel yr arwyddocād ystadegol gan ddadansoddiad o amrywiant (ANOVA) wedi'i ddilyn gan brawf-t Dunnett ar gyfer cymariaethau lluosog.p Ystyriwyd gwerthoedd llai na 0.05 yn arwyddocaol.
Dyfyniad salsa Cistanche
4. Casgliadau
Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ynysu ac egluro adeileddau pum glycosid newydd a amnewidiwyd ffenylpropanoid, o'r enw cistansalside AE (5, 6, 12, 17, a 18), yn ogystal ag ynysu a nodi 13 cyfansoddyn hysbys, gan ddefnyddio strategaeth dad-ddyblygu. Penderfynwyd mai'r cyfansoddion hysbys oedd lipedoside AI (1) [21], 23-acetylacteoside (2) [22], isocistanoside C (3) [15], osmanthuside B (4) [21], epimeridinoside A ( 7) [15], cistanoside D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubuloside E (10) [16], cistanoside M (11) [15], isomartynoside (13) [24], salsaside C (14) [6], jionoside C (15) [25] a salsaside F (16) [6]. Sefydlwyd eu strwythurau trwy ddadansoddi data sbectrosgopig helaeth a thrwy gymharu â data a adroddwyd yn y llenyddiaeth. Cadarnhawyd bod strwythurau glycosidau amnewidiol ffenylpropanoid a ragfynegwyd yn betrus wedi'u cyfateb yn gywir i'w strwythurau go iawn.
Budd dyfyniad salsa Cistanche
Cyfeiriadau
1. Shimamura, H. ; Miyazawa, M.A.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Atal Gweithgaredd sy'n Ysgogi SOS o Trp-P-1 gan Asidau Brasterog o Cistanche salsa yn y Prawf Salmonela Typhimurium TA1535/pSK1002 umu. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Jeon, E. ; Chung, K.-S.; An, H.-J. Effeithiau Gwrth-Amlder salsa Cistanches ar Ddilyniant Hyperplasia Prostatig Anfalaen. Gall. J. Physiol. Ffarmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X. ; Xu, R. ; Wang, Y.; Zhou, Q. ; Sun, S. Gwahaniaethu'n Gyflym ar Herba Cistanches trwy facro-olion bysedd isgoch aml-gam ynghyd â modelu annibynnol meddal o gyfatebiaeth dosbarth (SIMCA). Sbectrochim. Acta Rhan A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Gwahaniaethu Herba Cistanches yn ôl olion bysedd gyda chromatograffeg hylif perfformiad uchel-arae deuod canfod-sbectrometreg màs. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Astudiaethau ar Gyfansoddion Cistanchis Herba. V. Ynysu ac Adeiledd Dau Glycosidau Phenylpropanoid Newydd, Cistanosides E ac F. Cemeg. Pharm. Tarw. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6.Lei,L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Glycosidau newydd o Cistanche salsa. Helv. Chim. Deddf 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Astudiaeth gyfansoddol o gyfansoddion ffenolig o Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, yn tyfu yng Ngweriniaeth Kazakhstan. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Gwell croniad o glycosidau ffenylethanoid trwy fwydo rhagflaenydd i ddiwylliant atal dros dro Cistanche salsa. Biocemeg. Eng. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Maruyama, A.S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Mae detholiad salsa Tachibana, H. Cistanche yn gweithredu'n debyg i brotein-glwm
polysacarid-K (PSK) ar wahanol fathau o linellau cell. J. Traddodiad. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Mae glycosidau ffenylethanoid o Cistanches salsa yn atal apoptosis a achosir gan 1-methyl-4-ïon ffenylpyridiniwm mewn niwronau. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11.Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Cysyniadau Newydd, Dulliau Arbrofol, a Strategaethau Dad-ddyblygu ar gyfer Darganfod Ffyto-estrogenau Newydd o Ffynonellau Naturiol. Med Planta. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Mae ynysu adfeiliad wedi'i dywys ar wahân i'r aflavins ST a lecanora DF oddi wrth y ffwng endoffytig Setophoma sp. Ffytocemeg 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J. ; Slebodnik, C. ; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R. ; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Cyfansoddion antiproliferative a gwrthplasmodial o rywogaethau Streptomyces dethol. Bioorg. Med. Cemeg. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14.Jiang, Y. ; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Ynysu saponinau triterpenoid hepatoprotective newydd wedi'u harwain gan ddad-ddyblygiad o Semen Celosiae gan gromatograffaeth hylif perfformiad uchel ynghyd â sbectrometreg màs ïoneiddiad electrochwistrellu tandem pedwarplyg–amser hedfan. J. Pharm. Biomed. Rhefrol. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15.Zhang, J. ; Li, C. ; Che, Y.; Wu, J. ; Wang, Z.; Cai, W. ; Li, Y. ; Ma, Z. ; Tu, P. Strategaeth seiliedig ar LTQ-Orbitrap ar gyfer meddygaeth Tsieineaidd draddodiadol wedi'i thargedu darganfyddiad dosbarth, adnabod a'i hymchwil omeg: Astudiaeth achos ar glycosidau ffenylethanoid mewn tair rhywogaeth wahanol o Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Etholwyr Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. dd. II. Ynysu a Strwythurau Glycoside Ffenylethanoid Newydd a Glycoside Neolignan Newydd. Cemeg. Pharm. Tarw. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T. ; Nakashima, T.; Ueda, T. ; Tomii, K.; Kouno, I. Hwyluso Gwahaniaethu ar Enantiomers Aldose gan HPLCistancheChem Cyfnod Gwrthdroi. Pharm. Tarw. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B. ; Li, N. Astudiaeth o asid cis-cinnamic yn Arabidopsis thaliana. Physiol Planhigion. Biocemeg. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Traws-Cis-Ecwilibriwm Asidau Hydroxycinnamic yn ystod Arbelydru Atebion dyfrllyd ar pH Gwahanol. Ffytocemeg 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
