Dyfyniad brych mochyn yn cynyddu'r lefelau NAD Cellog mewn Ceratinocytes Epidermaidd Dynol Ⅱ
Jun 25, 2023
Trafodaeth
Mae llawer o astudiaethau wedi dangos bod ygostyngiad yn NADoherwydd heneiddio yn cydberthyn i'rdirywiad swyddogaethol meinweoedda'rdatblygu clefydau sy'n gysylltiedig ag oedran a chanser11,22. Yn yr epidermis, mae arbelydru UV, ffactor anghynhenid pwysicaf heneiddio'r croen, yn achosi disbyddiad NAD yn ogystal âheneiddio cronolegol23. Gan fod y croen yn agored yn gyson i arbelydru UV ym mywyd beunyddiol, mae'n ymddangos bod defnyddio cyfryngau hybu NAD yn amserol yn ddull rhesymol o atal lleihau NAD ac amddiffyn y croen rhag niwed UV. Yn wir, dangoswyd bod gwella NAD yn y croen yn atal canser y croen a achosir gan UV a gwrthimiwnedd mewn llygod24. Jacobson et al. adrodd bod deilliadau asid nicotinig cyfoes yn cynyddu cynnwys NAD ar y croen ac yn gwella swyddogaeth rhwystr25.

Cliciwch Yma I Gael Cistanche - Y Perlysiau Gwrth-Heneiddio Gorau
Yn ogystal, mae sawl astudiaeth glinigol wedi dangos bod defnydd amserol o ragflaenydd NAD NAM yn lleihauarwyddion o heneiddio croen26,27. Mae'r data in vivo a chlinigol hyn yn cefnogi'r posibilrwydd y bydd lefelau NAD uwch yn atalniwed i'r croen ac oedi heneiddio. Rydym hefyd wedi adrodd yn flaenorol bod cynnal lefelau NAD digonol yn hanfodol ar gyfer amddiffyn celloedd epidermaidd dynol rhag straen UV21. Yn yr astudiaeth hon, gwnaethom ddangos bod PPE yn gwella lefelau NAD mewngellol mewn keratinocytes. Gwelsom hefyd fod gan ei gynhwysion gweithredol LMW o lai na 3 kDa, sy'n effeithiol ar gyfer modelau diwylliant epidermis monolayer a 3-dimensiwn. Mae'r canfyddiadau hyn yn awgrymu y gallai cynhwysion actif PPE gael eu hamsugno'n drawsdermol ac felly'n amlygu ei ddefnydd posibl fel asiant amserol ar gyfer hybu lefelau NAD croen.


Tabl 1. Cynnwys rhagflaenydd NAD o PPE.
Yn y croen, mae diffyg NAD yn lleihau swyddogaeth y prif lwybrau metabolaidd ynni, megis glycolysis a ffosfforyleiddiad ocsideiddiol. Mae glycolysis yn anhepgor ar gyfer cynnal cydbwysedd rhwng amlhau ceratinocyte a gwahaniaethu28. Mae amlygiad UV yn gostwng lefelau NAD ac felly fe allai gyflymu'r anghydbwysedd hwn. Gwelwyd bod y gymhareb gwahaniaethu i amlhau wedi cynyddu'n sylweddol mewn croen sy'n agored i'r haul o gymharu â chroen a ddiogelir gan yr haul29. Mae Tan et al. wedi canfod bod triniaeth FK866 wedi cyflymu gwahaniaethu ac yn lleihau gweithgarwch meta bolig mewn NHEKs, a bod NAM wedi gwrthdroi'r digwyddiadau hyn a achosir gan FK866- trwy adfer lefelau NAD cellog28.

Ffigur 4. Mae PPE argroenol yn dangos gweithgaredd adfer NAD ond nid yw'n effeithio ar weithgaredd metabolig celloedd, yn RHE. (A) Darlun sgematig o'r model RHE. (B) Rhoddwyd PPE (2 mg/mL) ar ochr stratum corneum RHE a'i ddeor am 48 h ym mhresenoldeb neu absenoldeb FK866 (5 nM). Penderfynwyd ar gyfanswm lefelau meinweoedd NAD gan ddefnyddio pecyn assay NAD plus/NADH. (C) Cymhwyswyd PPE (0, 1, 2, neu 10 mg/mL) neu 1 y cant TX-100 (fel y rheolaeth gadarnhaol) ar ochr stratum corneum RHE a'i ddeor am 48 h. . Pennwyd gweithgaredd metabolig y gell gan assay MTT. **t<0.01, the comparison to the control.
Yn yr astudiaeth bresennol, canfuom fod PPE wedi adfer y disbyddiad NAD a achoswyd gan FK. Felly, gallai penderfynu a all PPE gynnal gwahaniaethu ac amlhau yn yr epidermis sydd wedi'i ddihysbyddu NAD ddarparu gwell sefyllfa.dealltwriaeth o'imecanwaith gwrth-heneiddio.

Yn ddiweddar, mae Aioi et al. dangos bod defnydd amserol o PPE yn lleihau crychau wyneb yn sylweddol ac yn gwella hydradiad croen17. Dangosodd ein prawf clinigol blaenorol fod cymhwyso hufen PPE yn amserol wedi arwain at welliant sylweddol mewnparamedrau heneiddio gwrth-groen, felcrychau,hydradiad croen, sagging, a bagiau llygaid (data heb ei gyhoeddi). Gall canfyddiadau'r astudiaeth hon gyfrannu at ddealltwriaeth o'r mecanwaith gwaelodol y mae PPE yn ei ddefnyddio i leihau crychau a gwella hydradiad y croen. Dangosodd adroddiad blaenorol fod cydberthynas gadarnhaol rhwng cyfanswm lefelau NAD mewngellol a mynegiant cydrannau matrics allgellog, fel procolagen ac elastin, mewn fbroblasts croen dynol30. Mae trin ffibroblastau â PPE yn arwain at gynhyrchu mwy o golagen math I17. Ar y cyd â'r ffeithiau hyn, gall PPE hyrwyddo cynhyrchu colagen trwy gynyddu cynnwys NAD o fewn ffibroblastau, a allai arwain at leddfu crychau croen a welwyd mewn treialon clinigol. Mae hydradiad croen yn gysylltiedig yn agos â swyddogaeth rwystr yr haen epidermaidd. Mae sawl astudiaeth wedi awgrymu bod NAD yn gyd-ffactor hanfodol ar gyfer cynnal swyddogaeth rhwystr croen. Roedd Ming et al. dangos bod y deacetylase SIRT1 sy'n ddibynnol ar NAD yn rheoleiddio mynegiant ffilagrin, sy'n chwarae rhan hanfodol fel protein rhagflaenol ffactorau lleithio naturiol mewn cyfanrwydd rhwystr croen31. Yn ogystal, dangosodd astudiaeth glinigol fod y defnydd amserol o asiant hybu NAD wedi lleihau colledion dŵr trawsepidermol yn sylweddol, ynghyd â chynnydd mewn trwch stratum corneum mewn croen wedi'i ddifrodi â llun25. Mae'r adroddiadau hyn yn awgrymu y gallai PPE wella swyddogaeth rhwystr croen trwy gynyddu lefelau NAD cellog yn yr epidermis, gan arwain yn ôl pob tebyg at hydradiad croen gwell a nodir mewn treialon clinigol.
Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, dangoswyd bod atgyfnerthwyr NAD yn ddefnyddiol wrth wella effeithiau gwrthocsidiol a gwrthlidiol. Mewn modelau llygoden diabetig a septig, fe wnaeth gweinyddiaeth NR leihau llid yr ymennydd braster uchel a achosir gan ddeiet yn sylweddol ac atal straen ocsideiddiol endothelaidd a achosir gan lipopolysaccharid, yn y drefn honno 32,33. Yn debyg i NR, dangoswyd bod ychwanegiad NMN mewn llygod oedrannus yn gwrthdroi'r proffil mynegiant mRNA pro-llidiol yn yr uned niwrofasgwlaidd ac yn gwella swyddogaeth gardiofasgwlaidd trwy leihau straen ocsideiddiol34,35. Yn ogystal, datgelodd treial clinigol mewn dynion oed fod NR llafar wedi gostwng lefelau'r cytocinau llidiol sy'n cylchredeg36. Gyda'i gilydd, mae'r astudiaethau in vivo a chlinigol hyn yn cefnogi'r syniad bod cymhwyso asiantau hybu NAD yn darparu effeithiau gwrthocsidiol a gwrthlidiol. Mae gweithgaredd SIRT uwch wedi'i awgrymu fel un o'r mecanweithiau credadwy y mae'r atgyfnerthwyr NAD hyn yn cael effeithiau gwrthlidiol a gwrthocsidiol. Mae'n hysbys bod gan PPE effeithiau gwrthocsidiol a gwrthlidiol15; fodd bynnag, ychydig iawn o archwilio mecanistig a wnaed hyd yma. Mae'r astudiaeth bresennol yn rhoi o leiaf esboniad rhannol o effeithiau PPE.
Mae'n hysbys bod PPE yn cynnwys digonedd o broteinau sy'n hybu twf celloedd fel laminin, cytocinau, a ffactorau twf. Mae astudiaethau diweddar, gan gynnwys ein un ni, wedi golygu bod lefelau NAD cellog yn gysylltiedig â thwf celloedd mewn keratinocytes epidermaidd21,28. Felly, gwnaethom ddyfalu y gallai rhai o'r proteinau hyn gyfrannu at y cynnydd mewn cynnwys NAD. Fodd bynnag, yn groes i'n disgwyliadau, canfuom fod cyfran sy'n cynnwys moleciwlau pwysau moleciwlaidd isel o lai na 3 kDa yn hyrwyddo cynhyrchu NAD mewn keratinocytes. Yn ddiddorol, datgelodd ffracsiynu'r gyfran PPE gan ddefnyddio HPLC mai dim ond mewn ffracsiwn 3 y gwelwyd cynhyrchu NAD. Gwelsom hefyd fod rhagflaenwyr NAD, megis NMN, NR, a NAM, yn bresennol yn y ffracsiwn hwn, gan awgrymu y gallent esbonio'r effaith o PPE ar gynhyrchu NAD, yn rhannol o leiaf. Fodd bynnag, gan fod crynodiadau isel iawn o bob cyfansoddyn sydd wedi'i gynnwys mewn PPE, mae'n ymddangos yn anodd esbonio mai'r cyfansoddion hyn yn unig sy'n gyfrifol am allu PPE i hyrwyddo cynnwys NAD mewn keratinocytes. Mae adroddiadau diweddar wedi dangos bod gan ffurfiau llai y rhagflaenwyr NAD hyn, NRH ac NMNH, fwy o allu i gynhyrchu NAD na NR ac NMN37-40. Er bod angen dadansoddiadau pellach i benderfynu a yw PPE yn cynnwys NRH ac NMNH, gellir priodoli gallu hybu NAD PPE a arsylwyd yn yr astudiaeth hon i gyfoethogwyr NAD lluosog, gan gynnwys NMN, NR, NMNH, NRH, a rhagflaenwyr NAD anhysbys eraill.

Defnyddiau a dulliau
tymheredd mewn sychwr, mesurwyd y pwysau gyda chydbwysedd manwl gywir. Roedd cynnwys solet sych PPE yn 10.98 mg/mL.

Diwylliannau celloedd.
Cafodd NHEKs (newydd-anedig / gwrywaidd, Termo Fisher Scientifc, Waltham, MA, UDA) eu meithrin mewn cyfrwng EpiLife™ yn cynnwys calsiwm 60 μM wedi'i ategu ag atodiad twf ceratinocyte dynol (y ddau gan Termo Fisher Scientifc) ar 37 gradd mewn awyrgylch llaith gyda 5 y cant CO2 . Newidiwyd y cyfrwng bob yn ail ddiwrnod nes bod y diwylliant yn cyrraedd cydlifiad o tua 50 y cant, ac ar ôl hynny fe'i newidiwyd bob dydd. Pasiwyd y celloedd pan gyrhaeddant 80-90 y cant cydlifiad. Ni ddefnyddiwyd NHEKs y tu hwnt i ddarn 5.
Assay meintioli ac adfer NAD.
Mesurwyd swm NAD gan ddefnyddio'r NAD plus /NADH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Yn gryno, cafodd 1.0 × 105 NHEKs eu hadu i mewn i 12-blatiau ffynnon. Ar ôl 24 h, cafodd celloedd eu trin â PPE mewn gwahanol opsiynau dwysfwyd (0, 0.25, 0.5, ac 1 mg/mL) a'u meithrin am 1-24 h ym mhresenoldeb neu absenoldeb 5 nM FK866 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, UDA). Cafodd y celloedd eu gorchuddio â byffer echdynnu NAD plus /NADH a gyflenwir a'u hidlo'n uwch gan ddefnyddio dyfais hidlo allgyrchol Ultracel-10 K (Merck, Darmstadt, yr Almaen). I gyfrifo crynodiad NADH, cafodd hanner yr hidlwyr eu deor ar 60 gradd am 60 munud i ddadelfennu NAD plus . Roedd yr holl hidlwyr yn destun yr adwaith ensymatig ar 37 gradd am 1 h. Yna, mesurwyd amsugnedd y samplau ar 450 nm gan ddefnyddio darllenydd plât Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, y Swistir). Cyfrifwyd y cynnwys NAD plws trwy dynnu'r cynnwys NADH o gyfanswm cynnwys NAD. Cafodd lefelau NAD plus / NADH eu normaleiddio i'r crynodiadau protein priodol a bennwyd gan ddefnyddio assay protein BCA Pierce (Thermo Fisher Scientific).
gyda 300 μL o hydoddiant 1 mg/mL MTT (Thermo Fisher Scientific) ar 37 gradd a 5 y cant CO2 am 3 h. Ar ôl golchi tair gwaith gyda PBS, echdynnwyd formazan wedi'i ymdreiddio mewn NHEKs gyda 200 μL o sulfoxide dimethyl ar dymheredd ystafell am 2 h. Penderfynwyd ar amsugno optegol ar 560 nm gan ddefnyddio darllenydd plât Infinite 200 Pro (Tecan).
Ultrahidlo PPE. Cymhwyswyd PPE (500 μL) i ddyfais flter allgyrchol Ultracel-3K (Merck Millipore) a'i allgyrchu ar 16,100 × g ar 4 gradd am 60 munud. Defnyddiwyd yr hidlyddion fel ffracsiwn LMW o PPE. I adennill y gweddillion ar yr hidlydd, gosodwyd y dyfeisiau hidlo wyneb i waered mewn tiwb centrifuge newydd a'u centrifugio ar 1000 × g ar 4 gradd am 5 munud. Cafodd gweddillion te eu hailgyfansoddi â 500 μL o halwynog wedi'i glustogi â ffosffad (PBS) a'i ddefnyddio fel ffracsiwn HMW o PPE.
min: dal ar 100 y cant hydoddydd A o 0 i 10 munud, yna graddiant llinol o 0 y cant B mewn 10 munud i 95 y cant B mewn 30 munud. Casglwyd eluents mewn tiwbiau sampl bob 2 funud a'u sychu gan ddefnyddio anweddydd allgyrchol CVE-3100 (EYELA, Tokyo, Japan). Cafodd y gweddillion eu hailgyfansoddi â 100 μL o PBS a'u hidlo trwy bilen 0.22 μm cyn defnyddio assay adfer NAD.
Dadansoddiadau o ragflaenwyr NAD.
Canfuwyd a mesurwyd NMN, NR, a NAM trwy wanhau isotop LC-MS/MS. Perfformiwyd dadansoddiadau gan ddefnyddio system Dosbarth H ACQUITY UPLC ynghyd â sbectromedr màs pedwarpol triphlyg TQS-micro (Waters, Milford, MA, UDA) gydag ïoneiddiad electrochwistrellu yn cael ei weithredu mewn modd ïon positif. Defnyddiwyd colofn Capcell Pak ADME HR (2 μm, 2.1 × 100 mm, Osaka Soda, Osaka, Japan) i wahanu pob sampl. Camau symudol A–B oedd dŵr–methanol (yn cynnwys {{10}}.1 y cant o asid fformig ac 10 mM formate amoniwm). Roedd cyflwr y graddiant fel a ganlyn: 0–0.5 mun (99 y cant A), 0.5–3 munud (99–60 y cant A), 3–5 munud (60–2 y cant A), a 5–7 munud (2 y cant A). Y gyfradd llif oedd 0.2 mL/munud. Y foltedd capilari oedd 0.75 kV, tymheredd y ffynhonnell oedd 150 gradd, a thymheredd y dadfeddiant oedd 500 gradd. Y llif nwy côn oedd 50 L/h a llif y nwy diddymu oedd 1100 L/h. I feintioli pob rhagflaenydd NAD, ychwanegwyd NAM-13C6 at y samplau ar grynodiad o 78 nM fel safon fewnol. Cafodd yr ïonau eu monitro gan ddefnyddio monitro adwaith lluosog (MRM) gyda'r trawsnewidiadau canlynol: m/z 335→123 ar gyfer NMN, m/z 255→123 ar gyfer NR, m/z 123→80 ar gyfer NAM, ac m/z 129→85 ar gyfer NAM{-13C6. Prynwyd NMN o'r Oriental Yeast (Tokyo, Japan). Cafwyd NR a NAM-13C6 gan Merck (Darmstadt, yr Almaen). Prynwyd NAM gan Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan).
RHE. Prynwyd y model RHE in vitro EpiDerm™ (EPI-200) gan MatTek (Ashland, MA, UDA) a'i feithrin mewn EPI-100-cyfrwng ASY (MatTek) ar 37 gradd a 5 y cant CO2. Cymhwyswyd cant microlitrau o PPE (1, 2, a 10 mg/mL) neu 1 y cant TX-100 i ochr stratum corneum yr RHE. Deorwyd yr RHE am 48 h mewn cyfrwng EPI-100-ASY ym mhresenoldeb neu absenoldeb FK866 (5 nM). Ar ôl deori, cafodd yr RHE ei olchi deirgwaith gyda PBS. Ar gyfer assay adferiad NAD, mesurwyd cyfanswm y lefelau NAD yn RHE gan ddefnyddio'r NAD plus /NADH Assay Kit-WST. Ar gyfer assay gweithgaredd metabolig celloedd, trosglwyddwyd yr RHE i blât ffynnon 24- a'i ddeor â 300 μL o doddiant MTT 1 mg/mL (Thermo Fisher Scientific) ar 37 gradd a 5 y cant CO2 am 3 h. Ar ôl golchi tair gwaith gyda PBS, echdynnwyd formazan wedi'i ymdreiddio yn RHE gyda 2 mL o sylfocsid dimethyl ar dymheredd ystafell am 2 h. Penderfynwyd ar amsugno optegol ar 560 nm gan ddefnyddio darllenydd plât Infinite 200 Pro (Tecan). Defnyddiwyd yr amsugnedd ag 1 y cant TX-100 wedi'i drin RHE fel rheolaeth gadarnhaol ar gyfer assay gweithgaredd metabolig celloedd.
Dadansoddiad ystadegol. Cyflwynir data fel gwall cymedrig ±safonol cymedr o leiaf tri arbrawf annibynnol. Perfformiwyd yr holl ddadansoddiadau ystadegol gan ddefnyddio fersiwn meddalwedd EZR 1.55 (Saitama Medical
Cyfeiriadau
Appl. 11, 101–109 (2021).
Gofynnwch am fwy:
E-bost:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Ffôn: ynghyd â 86 15292862950







