Deall Didoli Capsidau Adenofirws ar ôl Mynediad; Cyfle i Newid Priodweddau Fector Brechlyn Rhan 1

Crynodeb:

Mae brechlynnau genetig sy'n seiliedig ar fector adenofirws wedi dod i'r amlwg fel strategaeth bwerus yn erbyn argyfwng iechyd SARS-CoV-2. Nid yw'r llwyddiant hwn yn annisgwyl oherwydd bod adenovirws yn cyfuno llawer o nodweddion dymunol brechlyn genetig. Maent yn imiwnogenig iawn ac mae ganddynt broffil pathogenig isel a nodweddir yn dda ynghyd â hawdd mynd at dechnoleg. Mae ymdrechion parhaus i wella fectorau adenofirws-brechlyn yn cynnwys defnyddio seroteipiau prin ac adenofirysau nad ydynt yn ddynol. Yn yr adolygiad hwn, rydym yn canolbwyntio ar y capsid firaol a sut mae'r dewis o genoteipiau yn dylanwadu ar y nifer sy'n eu derbyn a'r didoli isgellog dilynol. Rydym yn disgrifio sut y gall deall priodweddau capsid, megis sefydlogrwydd yn ystod y broses mynediad, newid tynged y gronynnau sy'n mynd i mewn a sut mae hyn yn trosi'n wahaniaethau mewn canlyniadau imiwnedd. Rydyn ni'n trafod yn fanwl sut mae treiglo'r protein capsid lytic bilen VI yn effeithio ar ddidoli firysau rhywogaethau C ar ôl mynediad ac yn trafod yn fyr a allai dulliau o'r fath gael goblygiadau ehangach wrth ddatblygu brechlynnau a/neu fectorau.

Cliciwch cistanche purcynnyrch

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Rhagymadrodd

Mae heintiau firaol, yn wahanol i heintiau bacteriol y gellir eu trin â gwrthfiotigau, yn parhau i fod yn fygythiad i iechyd gan mai ychydig iawn o feddyginiaethau gwrthfeirysol sy'n bodoli. Felly, brechu yw'r unig strategaeth sy'n berthnasol yn eang i amddiffyn poblogaethau dynol (ac anifeiliaid) rhag heintiau firaol.

Tan yn ddiweddar, ystyriwyd brechu yn erbyn heintiau firaol yn bennaf yng nghyd-destun atal afiechydon plentyndod neu fel yr ergyd "ffliw" blynyddol ar gyfer atal heintiau ffliw. Gyda dechrau'r argyfwng iechyd SARS-CoV-2 yn 2020, mae brechu wedi dychwelyd i ganol sylw'r cyhoedd gan ei fod bellach yn cael ei ystyried fel yr unig ffordd gynaliadwy allan o'r pandemig hwn. Yn y cyd-destun hwn, mae brechlynnau sy'n seiliedig ar fector adenovirws (Ad) wedi dod i'r amlwg fel un o ddwy strategaeth frechu lwyddiannus fawr. Yn dilyn cymeradwyaeth frys, mae brechlynnau Ad bellach yn cael eu chwistrellu i gyfran fawr o boblogaeth y ddaear mewn ymdrech ddigynsail i osod imiwnedd planedol yn erbyn SARS-CoV-2.

Ni chafodd brechlynnau fector adenofirws eu defnyddio'n eang cyn yr achosion o COVID{0}}, ond nid yw eu llwyddiant yn annisgwyl. Yn gyffredinol, mae firysau yn llwyfannau brechlyn addas iawn. Maent wedi'u optimeiddio'n fiolegol a'u haddasu ar gyfer cludo asid niwclëig, ac maent yn ennyn ymatebion imiwn. Mae gan adenofirysau lawer o nodweddion sy'n eu gwneud yn ymgeiswyr brechlyn arbennig o ddelfrydol. Mae ganddynt broffil pathogenig isel a nodweddir yn dda ynghyd â heintiad uchel. Maent yn dechnolegol hawdd mynd atynt ac wedi cael eu defnyddio'n helaeth ar gyfer fectoreiddio. Mae eu cynnyrch cynhyrchu uchel a sefydlogrwydd yn caniatáu cynhyrchu diwydiannol o dan amodau arfer gweithgynhyrchu da (GMP) ac yn darparu nodweddion ymarferol (hy, storio) ar gyfer dosbarthu rhanbarthol am gost is [1]. Ar ben hynny, mae cyflwyno celloedd Ad i gelloedd cyflwyno antigen yn effeithlon, ac maent yn naturiol yn ysgogi ymateb imiwn cynhenid ​​​​sy'n gweithredu fel cynorthwyydd i hybu llwyddiant brechu [2,3].

Mae deall bioleg Ad wedi bod yn hanfodol wrth ddatblygu fectorau sy'n seiliedig ar Ad (brechlyn). Er enghraifft, dewiswyd y defnydd o seroteipiau Ad nad ydynt yn ddynol neu brin yn rhai o'r brechlynnau SARS-CoV-2 sy'n cael eu marchnata ar hyn o bryd yn fwriadol i atal imiwnedd fector a oedd yn bodoli eisoes rhag lleihau effeithlonrwydd brechlynnau. Mae defnyddio fectorau wedi'u dileu â genynnau firaol yn darparu gwell diogelwch fector. Fodd bynnag, mae llawer o agweddau ar y cylch bywyd firaol o hyd nad ydynt wedi'u hystyried wrth ddatblygu fectorau brechlyn yn seiliedig ar Ad, ac mae gwybodaeth am genoteipiau prin neu annynol yn gyfyngedig, gan gynnwys y rhai a ddefnyddir ar hyn o bryd fel brechlynnau SARS-CoV-2 . Gyda'r adolygiad hwn, hoffem godi ymwybyddiaeth o addasiadau posibl y gellid eu hecsbloetio wrth ddatblygu fectorau Ad at ddibenion meddygol gan gynnwys brechu.

Rydym yn canolbwyntio ar y capsid firaol a sut mae'r dewis o genoteipiau yn dylanwadu ar y nifer sy'n eu derbyn a'r didoli isgellog dilynol. Rydym yn disgrifio sut y gall deall priodweddau capsid megis sefydlogrwydd yn ystod y broses mynediad newid tynged y gronynnau sy'n mynd i mewn a pha ganlyniadau imiwnedd gwahanol a welir. Fel enghraifft o sut y gellir newid sefydlogrwydd capsid a thynged, rydym yn trafod yn fanwl sut mae treiglo'r bilen lytic capsid protein VI yn effeithio ar firysau rhywogaeth C. Yn olaf, rydym yn trafod yn fyr a oes potensial i ddulliau o'r fath gael eu defnyddio ar gyfer datblygu brechlynnau a/neu fectorau.

1.1. Mae Adenoviruses yn Deulu Amrywiol o Pathogenau Heintus

Yn hanesyddol, cafodd Ad ei ynysu gyntaf ym 1953 o adenoidau cleifion â heintiau anadlol [4], ac yn fuan wedi hynny, mabwysiadwyd y term "adenovirus" yn gyffredinol [5]. Mae gan deulu Adenoviridae fwy na 120 o aelodau, wedi'u rhannu'n bum genera - yn dibynnu a ydynt yn heintio mamaliaid (ee, Mastadenoviridae), adar (ee, Aviadenoviridae), ymlusgiaid (ee, Atadenoviridae), amffibiaid (Siadenoviridae), neu bysgod (Ichtadenoviridae). ) [6,7]. Mae'r genws Mastadenoviridae hefyd yn cyfrif am fwy na 70 math o Hysbysebion dynol [8,9], sy'n cael eu dosbarthu i saith rhywogaeth (AG), yn ôl eu priodweddau morffolegol, biolegol a ffisigocemegol, fel y rhestrir yn Nhabl 1 [10, 11].

Ar ben hynny, gall Ads hefyd ailgyfuno'n ddigymell, a thrwy hynny gynhyrchu rhywogaethau newydd [12], fel yn achos AdE4, sef yr unig firws dynol rhywogaeth E ac sy'n debygol o fod wedi deillio o'r ailgyfuniad rhwng rhywogaeth ddynol B ac Ad simian [13 ]. Er bod heintiau mewn pobl â Hysbysebion annynol yn naturiol brin, nid ydynt yn amhosibl [14,15]. Mae gallu amrywiaeth o Hysbysebion nad ydynt yn ddynol i heintio (neu drawsddwytho) celloedd dynol yn eu gwneud yn llwyfannau fector deniadol (brechlyn). Yn eu plith mae Hysbysebion sy'n deillio o tsimpansî [16-18], gorilod [19], defaid [20], gwartheg [21], cŵn [21,22], neu fwnci'r byd newydd [23].

Gall heintiau adenofirws achosi gwahanol batholegau yn dibynnu ar eu tropism cellog neu feinwe gan gynnwys clefydau anadlol, llygadol, wrinol neu gastroberfeddol (gweler Tabl 1). Mae tropism meinwe yn aml yn ganlyniad i ddefnydd derbynyddion gwahanol gan wahanol Hysbysebion a gall hefyd fod yn gysylltiedig â sefydlogrwydd gronynnau cynhenid ​​[24]. Mae'r rhan fwyaf o heintiau gyda Hysbysebion yn ysgafn neu'n asymptomatig mewn gwesteiwr imiwnedd-alluog. Mae heintiau Ad Sylfaenol yn digwydd yn bennaf yn ystod plentyndod ac yn arwain at imiwnedd amddiffynnol cryf. Mewn cyferbyniad, mewn unigolion â gwrthimiwnedd, gall Ads achosi heintiau systemig heb eu rheoli, difrifol sy'n bygwth bywyd gan arwain at wenwyndra celloedd difrifol, a all arwain at lid gormodol a methiant organau lluosog, gan achosi marwolaethau uchel [12].

Yr Hysbysebion dynol a astudiwyd orau yw'r firysau rhywogaethau C math 2 a 5, a geir yn bennaf mewn cleifion â heintiau'r llwybr anadlol uchaf a'r gastroberfeddol [25] ac a fydd yn ffocws mawr yn yr adolygiad hwn. Gall adenovirws fod yn gyfrifol am achosion achlysurol, megis firysau rhywogaeth B sy'n achosi niwmonia (ee, Ad3, 7, a 14) ymhlith unigolion sy'n gymwys i imiwnedd [26] neu Ad40/41 o rywogaethau F ac Ad12, 18, a 31 o rywogaethau A , sy'n heintio'r llwybr gastroberfeddol (fel yr adolygwyd yn [26,27]). Mae firysau rhywogaeth D yn grŵp amrywiol iawn ac yn dueddol o ailgyfuno ac maent yn un o brif achosion heintiau llygaid [28].

1.2. Mae Capsidau Adenofirws yn Strwythurau Metastabl

Er gwaethaf eu hamrywiaeth, mae pob Hysbyseb yn dilyn fframwaith strwythurol a threfniadol tebyg. Firysau DNA heb eu hamgáu yw adenofirysau sy'n cynnwys genom DNA llinyn dwbl llinol cymharol fawr, 26–45 kb [29–31]. Mae'r capsid yn ~70-90 nm mewn diamedr ac mae ganddo ffurf icosahedron gyda 20 ffased a 12 fertig [32]. Mae'r capsid yn cynnwys tri phrif brotein strwythurol (hecson, penton, a ffibr) ac amrywiaeth o fân broteinau sment (hy, IIIa, VI, VIII, a IX mewn firysau rhywogaethau C) sy'n sefydlogi'r strwythur. Mae strwythur cydraniad uchel sawl capsid Ad wedi'i sicrhau trwy ficrosgopeg cryo-electron a chrisialugraffi pelydr-X [24,33-36]. Mae gan y capsid icosahedral strwythur ffug-T25 gyda 720 o exons wedi'u hymgynnull mewn trimers gwahanol yn dibynnu ar eu lleoliad yn y capsid. Mae 20 agwedd y capsid yn cynnwys naw exon wedi'u cydosod (GON fel y'i gelwir ar gyfer Grŵp o Naw), ond ar y 12 fertig, mae exons yn cael eu cydosod yn GOS (ar gyfer Grŵp o Chwech) (gweler [37,38] am ragor o fanylion ). Mae'r sylfaen penton pentameric yn cael ei fewnosod yn y 12 fertig ac mae'n sail ar gyfer y ffibr trimeric sy'n ymwthio allan [39,40]. Mae'r rhyngweithio rhwng proteinau capsid mawr a lleiaf yn sefydlogi'r capsid, yn bennaf trwy ryngweithio â hecsagonau.

Er enghraifft, mae GON wedi'i sefydlogi gan IX [41]; Mae IX a IIIa eu hunain yn cael eu sefydlogi gan eu rhyngweithio â VIII, sy'n eu cysylltu â GOS a GON, yn y drefn honno [37]. Mae moleciwlau VIII yn amlinellu'r GON ac yn helpu i sefydlogi hecsagonau y tu mewn i'r capsid. Mae Protein VI hefyd yn sefydlogi hecson trwy rwymo ceudod canolog y trimiwr hecson sy'n agored i'r lwmen firaol mewnol [42-44].

Mae'r capsid yn amgylchynu ac yn amddiffyn y craidd firaol sy'n cynnwys y genom firaol, y proteinau craidd firaol (hy, V, VII, Mu mewn firysau rhywogaeth C), a'r protein terfynol (TP), sydd wedi'i rwymo'n cofalent i bob pen 5' o y genom Ad. Mae proteinau capsid bach yn rhyngweithio â phroteinau craidd gan sefydlu cysylltiad rhwng capsid a genom; fodd bynnag, mae eu trefniadaeth ofodol ymhlith y proteinau craidd yn parhau i fod yn ddiffygiol. Dangoswyd bod V yn cynnal DNA y tu mewn i'r capsid trwy ryngweithio â VI (ochr capsid) a VII (ochr genom) [45-47] ac mae'n debyg ei fod yn cyfrannu at ryddhau genom yn y mandwll niwclear [48]. VII yw'r prif brotein capsid sy'n gysylltiedig â DNA firaol ac mae'n hyrwyddo ei anwedd y tu mewn i'r capsid [49–51]. Mae VII hefyd yn amddiffyn y genom firaol rhag canfod imiwnedd trwy ffactorau cellog [50,52-54]. Yn ddiddorol, dim ond yn Mastadenoviridae [55,56] y mae protein capsid IX a phrotein V yn bresennol, a gellir cynhyrchu capsidau firaol heb IX [57] neu brotein VII [58], gan ddangos rhywfaint o hyblygrwydd yn y strwythur capsid.

Mae genom Ads dynol yn amgodio ~45 o broteinau (gan gynnwys y proteinau adeileddol), wedi'u trefnu'n unedau trawsgrifio a reoleiddir dros dro [59]. Y ffactor trawsgrifio E1A yw'r protein a fynegwyd gyntaf ac mae'n angenrheidiol i gychwyn mynegiant genynnau firaol [60]. Mae'r genom hefyd yn gartref i ddilyniant amgynhwysiad 5' ac ailddarllediadau terfynell gwrthdro (ITR) ar bob eithaf sy'n ofynnol ar gyfer atgynhyrchu [59,61-64]. Mae adenovirws yn amgodio proteas adenofirol (AVP) sy'n cael ei bacio i'r gronyn ac yn prosesu sawl protein (hy, IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP, a 52.55K mewn firysau rhywogaeth C) [65-67]. Mae angen y cam hwn ar gyfer ffurfio gronynnau heintus aeddfed ac mae'n achosi ffurfio capsidau metasefydlog (hy, llai sefydlog) wedi'u paratoi ar gyfer dadosod capsid wrth atodi celloedd a mynediad [68,69]

Mae yna hefyd wahaniaethau rhywogaeth-benodol yn strwythur Hysbysebion dynol, ee, yn hyd ffibr a hyblygrwydd, sy'n effeithio'n uniongyrchol ar rwymo derbynyddion [70-72]. Gellir gweld gwahaniaethau hefyd yn y cynulliad penton. Gall pentonau o firysau rhywogaeth B ffurfio cysylltiadau rhyng-penton, gan arwain at ronynnau amgen a llai sefydlog tebyg i firws sy'n amddifad o genomau ac weithiau heb ffibrau. Gelwir gronynnau o'r fath yn dodecahedrons ac fe'u hastudir ar gyfer trosglwyddo celloedd plasmidau neu beptidau fel dewis amgen i fectorau Ad. Mae Dodecahedrons yn datgelu motiff peptid byr RGD yn well ym mhenton y mwyafrif o rywogaethau Ad, sy'n ofynnol i rwymo celloedd targed [73,74]. Gall gwahaniaethau mewn sefydlogrwydd capsid, fel y trafodir isod, fod yn briodwedd bwysig sy'n pennu tynged mynediad gronynnau Ad.

1.3. Adenoviruses Yn Dilyn Cylch Bywyd Lytig

Mae'r cylch haint Ad wedi'i adolygu'n helaeth mewn mannau eraill [75-77]. Yma, rydym yn canolbwyntio'n fyr ar ran mynediad y cylch bywyd, ac, oni nodir yn wahanol, byddwn yn cyfeirio at firysau rhywogaeth C, sef y rhai a astudiwyd orau (Ffigur 1). Mae adenoviruses yn defnyddio ffibr capsid fel y moleciwl atodiad celloedd cynradd. Mae'r rhan fwyaf o Hysbysebion, gan gynnwys firysau rhywogaeth C, yn defnyddio'r coxsackievirus a'r derbynnydd Ad (CAR) i rwymo celloedd targed [78-81]. Mewn cyferbyniad, mae rhai firysau rhywogaethau B yn rhwymo'r derbynnydd CD46 [82] neu desmoglein 2 [83] yn ffafriol, a dangoswyd bod rhai firysau rhywogaethau D yn rhyngweithio ag asidau sialig [84,85] neu'n uniongyrchol â v integrins (gweler Tabl 1) [ 86].

Felly, mae newid ffibr rhwng rhywogaethau yn strategaeth ddeniadol i newid tropiaeth [87–89]. Prif rôl y moleciwl ffibr yw cyfryngu'r cysylltiad corfforol â chelloedd targed, a ddilynir gan ail ryngweithiad rhwng penton ac integrins, megis v 5 [90]. Mae'r rhyngweithio hwn yn cael ei gyfryngu gan y motiff peptid RGD yn y dilyniant penton [91]. Mae absenoldeb y motiff hwn, fel mewn firysau rhywogaethau F, yn gysylltiedig â mynediad celloedd llai effeithlon [92]. Mae rhwymo integrin yn arwain at glystyru integrin ar wyneb y gell [93] sy'n sbarduno rhaeadru signalau, gan arwain at ad-drefnu'r cytoskeleton actin [94,95] a'r derbyniad endocytig trwy endocytosis cyfryngol clathrin neu ficropinocytosis [96,97]. Gall rhwymo RGD hefyd ansefydlogi'r capsid [98] trwy leihau cysylltiadau rhwng penton a hecson, gan helpu'r capsid i ddadorchuddio [99]. O ganlyniad, mae gronynnau Ad yn colli eu ffibr, a gall rhywun ddod o hyd i hecson a phenton datgysylltiedig y tu mewn i'r endosom [100–102]. Organyn deinamig yw'r endosom sydd wedi'i breimio i aeddfedu'n lysosomau diraddiol, ac mae'n rhaid i Hysbysebion ddianc yn gyflym i'r sytosol. Gall asideiddio endosom gyflymu'r broses ddianc trwy wanhau'r capsid ymhellach [100,103]. Mae'r broses dreiddiad endosome yn dibynnu ar ryddhau'r protein capsid mewnol VI [103,104].

Nodweddir y VI a ryddhawyd gan helics amffipathig N-terminal sy'n clymu i daflen fewnol yr endosome ac yn achosi crymedd pilen positif, gan arwain at rwygiad pilen sydd wedi'i gyfyngu'n lleol [75,103,105,106]. Mae celloedd yn ymateb i'r rhwygiad pilen a achosir gan firws ac yn actifadu ymateb awtophagi lleol i glirio'r organelle sydd wedi'i difrodi [107-109]. Er mwyn osgoi diraddio, mae Ads yn gosod awtophagy trwy fotiff peptid PPxY byr mewn protein VI nes bod y gronyn wedi cyrraedd diogelwch y cytosol [104,108]. Dangoswyd bod firysau rhywogaeth C yn dianc o endosomau cynnar [110]. Mae rhywogaethau eraill gan gynnwys A, B, a D yn traffig cyntaf i'r lysosom cyn dianc i'r cytosol [111-113], a allai effeithio ar y gweithrediad imiwnedd a ysgogwyd gan y firysau hynny [114].

Unwaith y bydd Ads wedi cyrraedd y cytosol, maent yn ymgysylltu â moduron dynein ac yn defnyddio cludiant ôl-radd ar hyd microtiwbwlau i gyrraedd y ganolfan drefnu microtiwb [115-117]. Mae'n debyg bod rhwymo modur yn cael ei gyfryngu gan hecson [115] ac efallai y bydd angen preimio asidig [118]. Yng nghyffiniau'r cnewyllyn, mae capsidau'n newid cyfeiriadedd trafnidiaeth, yn ôl pob tebyg trwy rwymo i broteinau modur kinesin a chronni wrth yr amlen niwclear [115,117,119,120]. Maent yn docio yn y cyfadeilad mandwll niwclear, yna caiff capsidau eu dadosod yn llwyr, a chaiff genomau eu rhyddhau a'u mewnforio i'r cnewyllyn [51,121-124]. Unwaith y tu mewn i'r cnewyllyn, mae'r cylchred yn parhau trwy actifadu'r genom gan drawsgrifio a mynegiant y genyn E1A cynnar uniongyrchol, sy'n gweithredu fel ffactor trawsgrifio ar gyfer pob uned trawsgrifio cynnar arall [60,125-130]. Yn dilyn mynegiant yr ensymau atgynhyrchu, mae genomau firaol yn cael eu hailadrodd ac yn cronni ar gyrion canolfannau atgynhyrchu [131].

Yna, mynegir proteinau strwythurol o'r uned mynegiant hwyr o dan reolaeth y prif hyrwyddwr hwyr [132,133]. Mae mynegiant genynnau hwyr yn arwain at gynhyrchu a chronni niwclear o'r holl broteinau strwythurol lle maent yn ymgynnull i epil ac yn pecynnu genomau sydd newydd eu syntheseiddio. Yna mae cynulliad niwclear y genhedlaeth nesaf o Hysbysebion yn arwain at gronynnau'n mynd allan a lysis celloedd [42,134-136]. Fel y soniwyd uchod, mae cydosod y capsidau yn cael ei ddilyn gan aeddfedu, hy, holltiad proteolytig nifer o broteinau capsid gan yr AVP i gynhyrchu gronynnau heintus [66]. Amlygir pwysigrwydd y broses hon gan y mwtant sy'n sensitif i dymheredd, Ts1 a nodwyd i ddechrau mewn sgrin mutagenesis yn Ad2. Ar y tymheredd nad yw'n ganiataol, mae'r mutant hwn yn methu â phecynnu'r AVP, ac nid yw gronynnau wedi'u cydosod yn aeddfedu, gan arwain at ronynnau hyper-sefydlog [137]. Cyflwynwyd y treiglad AVP cyfrifol yn enetig i Ad5 gan gadw'r ffenoteip hwn. Mae capsidau Ts1 yn dal i allu cysylltu â derbynyddion celloedd a chael eu endocytosed, ond yna maent yn dal yn gaeth yn yr endosome oherwydd eu methiant i ryddhau protein VI [103,138,139].

2. Imiwnedd Canfod Adenovirws

Mae adenofirysau yn gyffredin, ac mae mwyafrif helaeth o'r boblogaeth wedi wynebu'r firws hwn, yn bennaf yn ystod plentyndod. Mae adenofirysau yn imiwnogenig iawn, ac mae pob cyfarfyddiad yn ysgogi datblygiad imiwnedd gwrth-Ad penodol, cynhenid ​​​​ac ymaddasol, a all bara am oes. Mae hyn yn bwysig yn y frwydr yn erbyn y firws ac yn gwneud Ads yn llai niweidiol i'r gwesteiwr sy'n gymwys imiwn, ond gall fod yn rhwystr pan fydd Hysbysebion yn cael eu defnyddio fel fector mewn brechlynnau neu therapi genynnau [140,141]. Bydd deall sut mae Ad (a'i ddeilliadau fector) yn actifadu'r system imiwnedd yn ein galluogi i wella effeithiolrwydd a diogelwch brechlynnau. Dangosodd arsylwadau in vivo, gan gleifion sy'n cymryd rhan mewn treialon clinigol, yn glir y gall fectorau sy'n seiliedig ar Ad gymell actifadu imiwnedd cryf [142,143], weithiau gyda chanlyniadau angheuol [144].

Yn ogystal, mae astudiaethau amrywiol a gynhaliwyd mewn modelau in vitro neu anifeiliaid [145] yn awgrymu rôl allweddol y gronyn firaol ei hun (hy, DNA capsid a chorfforedig) wrth actifadu'r ymateb imiwn cychwynnol. Yma, rydym yn canolbwyntio'n fyr ar ymatebion imiwn sy'n gysylltiedig â'r capsid mynd i mewn; am drosolwg manylach, gweler adolygiadau a gyhoeddwyd yn flaenorol [146–149].

2.1. Adenoviruses Sbardun Imiwnedd Celloedd

Gyda datblygiad Ads fel fectorau, daeth yn amlwg bod imiwnedd cell-gynhenid ​​neu gynhenid ​​​​a achosir gan Hysbysebion yn ymateb i'r gwyriad goresgynnol. Yn ddiddorol, mae firysau atgynhyrchu ac nad ydynt yn atgynhyrchu (hy, firysau UV-anweithredol, fectorau nad ydynt yn atgynhyrchu, neu gapsidau gwag) yn actifadu ymatebion imiwn yn y celloedd heintiedig, gan ddangos bod gan y capsid rôl allweddol yn yr ymateb hwn [145,150-156] .

Yn gyffredinol, mae celloedd yn synhwyro hysbysebion ar sawl cam trwy gydol y cylch bywyd firaol cyfan ac yn actifadu llwybrau imiwnedd cynhenid ​​(Ffigur 1). Mae'r actifadu hwn yn dechrau gyda'r rhwymiad ffibr Ad i'r derbynnydd arwyneb cell CAR, sy'n actifadu'r signalau kinase protein-activated mitogen (MAPK) sy'n arwain at actifadu'r ffactor trawsgrifio NF-κB. Mae'r sbardun hwn yn arwain at gynhyrchu cytocinau pro-llidiol (IL-6, IL-8) [157,158]. Fodd bynnag, yn dibynnu ar rywogaethau Ad, gall defnydd derbynyddion eraill fodiwleiddio cryfder y rhaeadru signalau sy'n ymwneud â mynegiant cytocin [159]. Mae'r rhyngweithio rhwng penton firaol ac integrin cellog yn sbardun pellach i actifadu imiwnedd. Dangosodd astudiaeth mewn macroffagau murine fod y rhwymiad hwn yn actifadu mynegiant IL-1 trwy'r motiff RGD [160]. Gallai hyn gael ei gyfyngu i gelloedd imiwnedd oherwydd, mewn modelau celloedd eraill (ee, HeLa, llinell celloedd epithelial), ni chadarnhawyd rôl y rhyngweithio integrin / RGD mewn chemocines a chynhyrchu cytocinau pro-llidiol [151,161,162]. Mae hyn yn awgrymu rôl bwysicach i'r broses fewnoli ei hun mewn gweithrediad imiwnedd na'r rhyngweithio ag integrins. Yn wir, mae rhwymo penton i integrin hefyd yn actifadu'r signalau phosphoinositide 3-kinase (PI3K) i gynyddu mewnoli firaol [163].

Ar ben hynny, mae actifadu PI3K wedi'i ddangos ar haint Ad i sbarduno cynhyrchu cytocinau pro-llidiol, fel TNF [164], a disgrifiwyd y broses fewnoli fel un sy'n ofynnol ar gyfer actifadu imiwnedd [165]. Mae'r astudiaethau hyn yn awgrymu bod actifadu imiwnedd yn digwydd yn bennaf ar gam ôl-fewnoli, gan amlygu pwysigrwydd didoli ôl-fynediad (a adolygwyd yn [166]).

Unwaith y byddant yn yr endosome, mae Hysbysebion yn agored i dderbynyddion adnabod pathogen mewnluminal (PRR) fel TLR9, sy'n synhwyrydd DNA â llinyn dwbl wedi'i gyfyngu i gelloedd imiwnedd. Gall macroffagau Murine synhwyro fectorau Ad trwy TLR9 i gymell cynhyrchu cytocinau pro-llidiol [167]. Roedd angen TLR9 yn llym hefyd ar gyfer IFN / cynhyrchu pan heriwyd celloedd dendritig plasmacytoid murine (pDC) gydag Ad [168]. Fodd bynnag, mewn modelau llygoden sgil-allan TLR9, roedd IFN / yn dal i gael ei gynhyrchu, gan awgrymu, mewn celloedd heblaw pDC, bod cynhyrchu IFN yn digwydd yn annibynnol ar signalau TLR9 [168,169].

Mae genomau firaol (neu genomau fector) yn dod yn hygyrch i synhwyro yn ystod neu ar ôl i'r firws ddianc yn endosomaidd. Unwaith y byddant yn cyrraedd y cytosol, cânt eu synhwyro gan y synhwyrydd DNA llinyn dwbl cytosolig cGAS [168,170]. Ar ôl cydnabod genom firaol, mae cGAS yn hyrwyddo ffosfforyleiddiad a thrawsleoli niwclear y ffactor trawsgrifio IRF3 i yrru IFN / mynegiant, gan achosi cyflwr gwrthfeirysol. Mae llwybr endosomaidd yn gofyn am ddifrod i bilen endosomaidd a achosir gan firws i hwyluso dianc endosomaidd gronynnau firaol. Felly mae rhwygiad pilen yn cyfrannu'n sylweddol at actifadu imiwnedd, a amlygir gan y ffaith bod y mutant Ts1 diffygiol dianc yn methu ag actifadu ymateb imiwn cyflawn ac effeithlon [161,162,170,171]. Mae rôl ganolog yn yr ymateb llidiol ar dreiddiad pilen Ad yn cael ei chwarae gan y kinase rhwymo tanc, TBK1, a awgrymir ei fod yn rhan o synhwyro cytosolig i lawr yr afon o'r genom firaol trwy'r llwybr cGAS / STING [168,170].

Mae difrod pilen adenofirws hefyd yn arwain at ryddhau cathepsin B o'r adran endo-lysosomaidd, gan achosi straen ocsideiddiol, sy'n actifadu'r inflammasome NLRP3, gan arwain at aeddfedu IL-1 [114]. Mae firysau rhywogaeth C yn dianc o endosomau cynnar, tra bod rhywogaeth B yn firysau traffig tan endosomau hwyr, yn ôl pob tebyg oherwydd gwahaniaethau yn y defnydd o dderbynyddion. Mae asideiddio mewn endosome/lysosom hwyr yn fwy tebygol o actifadu hydrolasau asid lysosomaidd. Mae'r ddwy rywogaeth yn ysgogi actifadu llidus [172], ond, yn ôl pob tebyg oherwydd yr amser byw yn yr endosome, mae graddau eu hymatebion yn amrywio. Yn fyd-eang, mae firysau rhywogaeth B yn ysgogi actifadu imiwnedd cynhenid ​​​​ac addasol cryfach na firysau rhywogaeth C [113,173,174]. Efallai y bydd hyn yn esbonio pam mae firysau rhywogaeth B yn fwy pathogenig, gan achosi brigiadau mewn gwesteiwyr sy'n gymwys i imiwnedd [26]. Mae'n awgrymu ymhellach y gall celloedd wahaniaethu ar y compartment treiddiad (hy, endosome vs. lysosome, [109]) ac addasu effeithlonrwydd imiwnedd. Gall difrod i bilen endosomaidd yn ystod y broses dianc rhag Ad hefyd fod yn arwydd perygl ynddo'i hun. Fel y trafodir yn fanwl isod, mae difrod pilen yn arwain at amlygiad cytosolig o glycanau mewnluminal, sy'n cael eu canfod gan y gell fel signalau perygl (fel yr adolygwyd yn [109]). Mae canfod glycanau agored gan galectinau wedyn yn actifadu awtoffagi, gan sbarduno ail gangen o imiwnedd gwrthfeirysol [108].

2.2. Mae Adenovirws yn Ysgogi Ymateb Imiwn Addasol ac yn Gwrthdaro Autoffagi Gwrthfeirysol wrth i Gell ddod i mewn

Mae ymatebion imiwnedd cynhenid ​​​​a ysgogir gan Hysbysebion neu eu fectorau wedyn yn trosi'n imiwnedd addasol trwy secretion chemokine sy'n denu celloedd imiwnedd (neutrophils, celloedd lladd naturiol, a macroffagau) ac yn atgyfnerthu cyflwyniad antigen cryf [153,154]. Mae adenovirysau yn imiwnogenig iawn, a'u prif imiwnogenau yw'r prif broteinau capsid (hecson, penton, a ffibr) sy'n sbarduno'r cynhyrchiad rhywogaeth-benodol o niwtraleiddio gwrthgyrff gan gelloedd B [175-177].

Mae gwrthgyrff niwtraleiddio yn cael eu cyfeirio'n bennaf yn erbyn dolenni hyper-newidiol y protein hecson [178-180] ac yn cynrychioli cyfyngiad mawr ar y defnydd o Hysbysebion fel fectorau sy'n deillio o'r un seroteip. Mae'r broblem hon wedi'i goresgyn trwy ddefnyddio Hysbysebion llai seroprevalent neu nad ydynt yn ddynol [181-185]. Er gwaethaf yr imiwnedd gwrth-fector hwn, pan ddefnyddir Hysbysebion fel llwyfannau brechlyn (ee, i sicrhau amddiffyniad imiwn yn erbyn Ebola mewn treialon clinigol), maent yn dal i gymell ymateb celloedd B cryf, gan ganiatáu cynhyrchu gwrthgyrff yn erbyn yr imiwnogen brechlyn a ddymunir a all bara am hyd at 6 mis [186]. Yn ogystal, gellid goresgyn imiwnedd fector sy'n bodoli eisoes gyda dosau fector brechlyn uwch, fel yn achos fector brechlyn SARS-CoV-2 yn seiliedig ar yr seroprevalence uchel AdC5 [187].

Yn yr un modd â niwtraleiddio gwrthgyrff, mae heintiau Ad yn sbarduno imiwnedd celloedd T parhaus, yn bennaf trwy actifadu CD4 ynghyd â gweithrediad. Gellir dod o hyd i'r amddiffyniad hwn o hyd mewn oedolion, sy'n awgrymu imiwnedd parhaol o blentyndod [188-190]. Yn ogystal, disgrifir actifadu CD8 plus hefyd i gynnal ymateb sytotocsig [191-193]. Nid yw'r actifadu celloedd T hwn o reidrwydd yn benodol i seroteip ac mae'n caniatáu traws-amddiffyniad yn erbyn gwahanol is-grwpiau Ad a seroteipiau [192-194].

Ar ben hynny, mewn cleifion bôn-gelloedd-trawsblanedig sydd wedi'u heintio gan Ad, disgrifiwyd actifadu cryf o CD4 plus a CD8 plus [195]. Mae'r actifadu hwn wedi'i gyfeirio yn erbyn peptidau hecson ac mae'n arwain at glirio Ad viremia, gan bwysleisio rôl fawr CD4 plus a CD8 ynghyd ag actifadu celloedd T mewn amddiffyniad imiwn. Er bod yr imiwnedd hwn sy'n seiliedig ar gelloedd T yn cael ei gyfeirio yn erbyn y gronyn Ad, mae Ads hefyd yn sbarduno imiwnedd cellog cryf yn seiliedig ar ymateb Tcell yn erbyn yr antigen brechlyn, sy'n fantais ar gyfer imiwnedd hirdymor wrth ddefnyddio fectorau Ad ailgyfunol fel llwyfannau brechlyn [196,197 ]. Yn bwysig, mae data o dreialon clinigol wedi cadarnhau, pan ddefnyddir Ad fel llwyfan brechlyn (gyda'r antigen a ddymunir fel trawsgen), ei fod yn ysgogi CD8 sytotocsig ynghyd â chell T a CD4 ynghyd ag actifadu celloedd T, gan arwain at imiwnedd cof yn erbyn y mynegi trawsgene [184,186,198–202].

Mae actifadu celloedd T yn dibynnu ar gyflwyniad peptidau firaol trwy'r prif gymhleth histocompatibility (MHC). Yn gryno, mae cyflwyniad antigen gan MHC dosbarth I yn deillio o ddiraddiad proteasomal, a bydd y peptidau a geir yn cymell CD8 ynghyd ag actifadu celloedd T, gan ganiatáu preimio ac amlhau ymateb celloedd T sytotocsig. Mae cyflwyniad antigen dosbarth II MHC yn deillio o broteolysis lysosomaidd, a bydd y peptidau sy'n deillio o hyn yn ysgogi actifadu celloedd T CD4 ynghyd â T ar ôl eu cyflwyno, gan sbarduno gweithrediad dilynol celloedd B [203]. Mae'n cael ei nodweddu'n dda bellach bod autophagy yn hyrwyddo cyflwyniad peptid i'r moleciwlau MHC dosbarth II [204]. Nid yw'n syndod bod awtoffagi yn un o'r mecanweithiau amddiffyn hynaf yn erbyn haint ac yn rhan bwysig o'r repertoire cellog yn erbyn pathogenau goresgynnol, gan gymryd rhan mewn ymatebion imiwnedd cynhenid ​​​​ac addasol. Gall atafaelu pathogen yn uniongyrchol ar gyfer diraddio (senoffagi) ac mae'n cymryd rhan yn ei gyflwyniad i'r system imiwnedd [205-207]. Mae macroautophagi (a elwir yn fwy cyffredin yn awtophagi) yn llwybr diraddio lysosomaidd wedi'i gadw sy'n cymryd rhan mewn llawer o brosesau ffisiolegol sylfaenol fel homeostasis ac imiwnedd cynhenid ​​​​ac ymaddasol [208-210]. Nodweddir awtoffagi gan ffurfio fesiglen bilen ddwbl o'r enw "autophagosome" sy'n amlyncu cargoau cytoplasmig (hy, organynnau, agregau, a phathogenau) sydd i fod i ddiraddio (Ffigur 2). Yn ystod y broses hon, mae autophagosomau sy'n cynnwys cargo yn asio â lysosomau i'w diraddio a'u hailgylchu.

Mae cyflwyniad antigen trwy awtophagi wedi'i ddisgrifio ar gyfer dosbarth I MHC a dosbarth II [204]. Ar ôl sefydlu awtoffagi, mae antigenau mewngellol yn cael eu hamlyncu mewn awtoffagosomau, gan asio â MHC dosbarth II sy'n cynnwys adrannau i ddarparu deunydd pathogen allanol iddynt (Ffigur 2) [211]. Disgrifiwyd rôl awtoffagi yn y cyflwyniad antigen dosbarth II MHC penodol hwn gyntaf ar gyfer haint firws Epstein-Barr, lle arweiniodd ataliad awtophagi at ostyngiad mewn CD4 ynghyd ag actifadu celloedd T [212,213]. Hyd yn hyn, mae enghreifftiau'n cynnwys nifer o firysau gan gynnwys firws herpes simplex [214], firws ffliw [215], a firws imiwnoddiffygiant dynol math 1 (HIV-1) [216], ac mae'n debyg ei fod yn ymestyn i Hysbysebion (gweler isod). Mae cyflwyniad dosbarth II MHC yn gyson â'r broses o awtophagi gan ei fod yn fecanwaith amddiffyn cytosolig. Mae autophagy hefyd yn ymwneud â thraws-gyflwyniad dosbarth II MHC o antigenau allgellog [214]. Yn wir, mae cyflwyniad MHC o ofalbwmin allgellog yn fwy effeithlon pan fo'r peiriannau awtoffagi (ac yn enwedig ATG5) yn weithredol, a dangoswyd bod y defnydd o ddeunydd allgellog yn cynnwys ffurf an-ganonaidd o awtoffagi o'r enw ffagocytosis cysylltiedig â LC3-. LAP) [217].

Unwaith y bydd yn bresennol yn y LAP-rhai, gall rhai antigens allgellog gael eu hamlygu trwy gyflwyniad MHC dosbarth II [218]. Mae awtophagy hefyd yn ymwneud i ryw raddau â chyflwyniad dosbarth I MHC, er bod mwyafrif helaeth yr epitopau yn cael eu cyflwyno trwy fecanwaith sy'n dibynnu'n llwyr ar y cludwr sy'n gysylltiedig â'r cymhleth prosesu antigen (TAP) [219]. Hyd yn hyn dim ond o dan amodau disbyddu TAP [219,220] a ddangoswyd cyflwyniad annibynnol TAP wedi'i gyfryngu gan awtoffagy. Os yw'r dull hwn o gyflwyno yn bodoli mewn gwirionedd yn parhau i fod yn ddadleuol [221] ac yn cael ei drafod mewn man arall [204,222,223].

Er mwyn atal cyflwyniadau MHC, mae Ads yn cysegru llawer iawn o'u genom, sef rhanbarth E3, i danseilio system gyflwyno MHC mewn celloedd [224-228]. Yn y rhan fwyaf o fectorau (brechlyn), mae'r genynnau hyn yn absennol, ac mae gwaith diweddar yn awgrymu y gallai cynyddu cyflwyniad antigen gan MHC wella effeithlonrwydd brechlyn Ad [229,230]. Mae awtophagy yn chwarae rhan hanfodol wrth brosesu antigenau Ad ar gyfer cyflwyniad dosbarth II MHC mewn imiwnedd a achosir gan Ad [108,229].

Mae Montespan et al. dangos bod Hysbysebion yn achosi awtophagi ar dreiddiad endosome a bod mynd i mewn i ronynnau a gliriwyd gan awtophag yn y broses hon yn cael ei gyflwyno'n effeithlon i'r system imiwnedd [108]. Mae'r arsylwi hwn yn gyson â'r astudiaeth a gyhoeddwyd gan Klein et al. sy'n dangos, yng nghyd-destun Ads oncolytig, bod yr antigenau firaol yn cael eu haeddfedu gan ffurf awtoffagi sy'n ddibynnol ar JNK [229]. Fodd bynnag, mae awtoffagi yng nghyd-destun canser yn chwarae rhan ddeuol. Fel ceidwad homeostasis, mae awtoffagy yn cyfyngu ar gychwyn tiwmor [231] tra mewn awtoffagy canser datblygedig yn gweithredu fel proses oroesi i ffafrio twf tiwmor [232,233]. Felly, yng nghyd-destun fectorau oncolytig, dylid gwerthuso nodweddion autophagy tiwmor-benodol yn ofalus.

3. Adenoviruses fel (Brechlyn) Fectorau

Mae fectoreiddio firws yn golygu ymelwa ar ei briodweddau naturiol, gan leihau'r risg biolegol cysylltiedig ar yr un pryd. Yn y termau hyn, mae Hysbysebion yn ymgeiswyr fector ardderchog ar gyfer datblygu brechlyn [234]. Mae fectorau adenofirws yn sefydlog, yn hawdd i'w cynhyrchu i titer uchel, ac mae ganddynt alluoedd clonio mawr. Mae hyn yn caniatáu gosod trawsgen, hy, i fynegi antigen o ddewis. Mae ganddynt sbectrwm heintiad eang ac maent yn trawsddwytho celloedd nad ydynt yn rhannu, ac nid yw eu genom yn integreiddiol [1]. Fel y disgrifiwyd uchod, maent hefyd yn ysgogi ymateb llidiol mewn celloedd cyflwyno antigen (APCs) sy'n gwasanaethu swyddogaeth gynorthwyol i chwyddo'r ymateb imiwn sy'n angenrheidiol i frechu'n effeithlon [2,3,142,235,236].

Ar ben hynny, mae fectorau sy'n deillio o Ad wedi'u defnyddio'n helaeth mewn treialon preclinical a chlinigol i brofi eu diogelwch [237,238]. Er mwyn dileu'r rhan ddiangen o'r cylch atgynhyrchu, mae angen atal atgynhyrchu firaol i atal lysis celloedd a lluosogi firaol. Dechreuodd datblygiad fector adenofirws yn ystod y 1990au cynnar fel llwyfan ar gyfer ystod eang o ddulliau therapiwtig, megis therapi genynnau, fectorau oncolytig, a datblygu brechlynnau. Roedd y rhan fwyaf o'r datblygiadau fector cynnar yn fersiynau wedi'u haddasu o firysau rhywogaethau C.

3.1. Datblygu fector Adenovirws, Dull Cenhedlaethol

Gwnaethpwyd y genhedlaeth gyntaf o fector Ad trwy ddileu rhanbarth E1 ac E3 o'r genom firaol, yn arbennig amgodio'r ffactor trawsgrifio cynnar uniongyrchol, gan atal y fectorau hyn rhag dyblygu. Roedd gan y fectorau hyn gapasiti clonio o tua 8 kb i fewnosod trawsgen gyda dilyniannau rheoliadol [239–241]. Cynhyrchwyd y fectorau cenhedlaeth gyntaf mewn celloedd aren embryonig dynol (HEK) a drawsnewidiwyd yn sefydlog gyda rhan o'r genom firaol Ad5 sy'n ategu rhanbarth E1 mewn traws [242-247]. Un o brif anfanteision y system hon yw ei bod yn caniatáu ailgyfansoddi genomau sy'n gymwys atgynhyrchu ar ôl ailgyfuno'n ddigymell [248]. Mae dileu ychwanegol E3, nad yw'n angenrheidiol ar gyfer cynhyrchu fector, yn cynyddu maint y casét transgene [243] ac yn hyrwyddo ymateb imiwnedd gwell [240].

Yn anffodus, nid oedd fectorau Ad cenhedlaeth gyntaf yn gwbl anadweithiol yn drawsgrifiadol ac yn dal i ennyn ymateb imiwn cryf yn erbyn proteinau capsid firaol a fynegwyd ar lefelau gwaelodlin [141,249,250]. Cyfrannodd yr imiwnedd lentivector hwn at wenwyndra fector a dileu celloedd transduced yn y tymor byr [145]. Roedd yr ail genhedlaeth o fectorau Ad hefyd wedi tynnu'r rhanbarthau E2 ac E4 o'r genom fector. Mae E2 yn amgodio'r ensymau atgynhyrchu ac E4 proteinau rheoleiddio ychwanegol [251-253]. Roedd hyn yn caniatáu lle i 10.5 kb o ddilyniannau trawsgen, gan gynnwys hyd at bedwar casét mynegiant [254]. Yn yr un modd, roedd y dileadau atodol yn lleihau'n gryf ailgyfuniad diangen a mynegiant trawsgen hirfaith [255]. Mae'n debyg bod hyn o ganlyniad i fynegiant genynnau firaol llai afreolaidd sy'n lleihau imiwnedd gwrth-fector ymhellach [141,250,251]. Mae fectorau adenofirol y drydedd genhedlaeth yn wahanol yn gysyniadol. Maent yn cynnwys genom fector wedi'i becynnu a genom firaol heb ei becynnu (firws cynorthwy-ydd) sy'n cynhyrchu gronynnau fector. Gelwir fectorau o'r fath hefyd yn fectorau "dibynnol ar gynorthwyydd", "diberfedd", neu fectorau "capasiti uchel" (HC-Ad). Mae ganddynt y cynhwysedd clonio uchaf posibl a gallant gario dilyniannau o hyd at 36 kb [256–258]. Nid oes gan Hysbysebion gallu uchel unrhyw ddilyniant codio firaol ac eithrio ITRs a signal amgáu byr sy'n caniatáu pecynnu genom ac sy'n absennol o'r firws cynorthwy-ydd [259-262]. Mae'r strategaeth hon wedi caniatáu inni oresgyn y rhan fwyaf o imiwnedd gwrth-fector o'r diwedd, gan ganiatáu mynegiant hirdymor trawsgenau [263-267]. Fodd bynnag, nid yw HC-Ads yn rhan o'r repertoire fector brechlyn cyfredol.

3.2. Adenovirws fel fector brechlyn

Cyn archwilio sut y mae fectorau Ad wedi cael eu hecsbloetio, mae'n werth nodi y datblygwyd brechu yn erbyn firysau rhywogaeth Ad math 4 a math 7 eu hunain yn gynnar yn y 1970au [268]. Mae'r brechlyn byw geneuol hwn yn orfodol ers 2011 ar gyfer recriwtiaid milwrol yn UDA a gostyngodd cyfraddau haint yn ddramatig, gan gyrraedd bron sero [269-271]. Tynnodd hyn sylw at effeithlonrwydd a diogelwch cynhenid ​​​​Ads fel brechlyn ac agorodd y maes i ddefnyddio Ads fel llwyfan brechu. Hyd yn hyn, aeth dros 200 o frechlynnau ar sail Ad i mewn i dreialon clinigol [272]. Mae llawer ohonynt wedi'u cyfeirio yn erbyn pathogenau heintus megis HIV-1 ac Ebola [230,273,274]. Nid yw brechlynnau sy'n seiliedig ar adenofirws heb anfanteision. Roedd brechlyn gwrth-HIV a ddatblygwyd yn ddiweddar, yn seiliedig ar y rhywogaeth C firws Ad5, yn defnyddio cymysgedd o fectorau yn mynegi'r genynnau gag HIV, pol, a nef [275,276]. Roedd y fectorau yn ddiogel, yn imiwnogenig, ac yn cael eu goddef yn dda. Yn anffodus, bu'n rhaid atal y treial clinigol STEP a ddeilliodd o hynny yn gynamserol [277-279]. Nid yn unig y dangoswyd nad yw'r brechlyn hwn yn amddiffyn rhag haint HIV, ond roedd data epidemiolegol yn awgrymu bod brechu ag Ad yn yr achos hwn yn cynyddu'r risg o haint HIV [280-282]. Nodwyd bod ag imiwnedd sy'n bodoli eisoes yn erbyn Ad5 fel ffactor risg ôl-frechu posibl [283,284]. Fodd bynnag, ni chadarnhawyd yr arsylwad hwn mewn astudiaethau tebyg [285,286] ac mae'n parhau i fod yn aneglur yn fecanyddol [287,288]. Wrth ymyl HIV, mae brechlynnau fector sy'n seiliedig ar Ad wedi'u datblygu yn y frwydr yn erbyn Ebola (Ad-EBOV), bygythiad cyson yng Ngorllewin Affrica [289]. Mae pob brechlyn Ad-EBOV yn defnyddio'r Ebola glycoprotein (GP) fel antigen y brechlyn. Defnyddiodd treialon rhag-glinigol cychwynnol mewn cnofilod ac primatiaid Ad5 a dangoswyd amddiffyniad dros 3 mis gyda chynhyrchu gwrthgyrff niwtraleiddio a CD8 ynghyd ag actifadu [273,290-292]. Aeth y brechlyn hwn trwy dreial clinigol cam II; fodd bynnag, mae imiwnedd sy'n bodoli eisoes i Ad5 yn y boblogaeth sydd wedi'u brechu wedi arwain at amrywiad yn lefel y gwrthgyrff niwtraleiddio a gafwyd [293-297]. Er mwyn goresgyn y mater hwn, mae brechlynnau yn seiliedig ar rywogaethau llai cyffredin D Ad26 wedi'u datblygu [186,298,299].

Fodd bynnag, mae Ad26 yn llai imiwnogenig mewn bodau dynol, gan arwain at lai o effeithlonrwydd brechu, ac roedd angen hwb mawr gan ddefnyddio brechlyn yn seiliedig ar firws y frech goch (MVA). Mae'r drefn frechu hon wedi cyrraedd treialon clinigol cam III [289,300,301]. Mae'r defnydd o fectorau Ad nad ydynt yn ddynol hefyd wedi bod yn cael ei ddatblygu [184]. Dangosodd y defnydd o tsimpansî ChAd3 fel llwyfan brechlyn yn erbyn EBOV amddiffyniad mewn cnofilod a tsimpansïaid [302,303], ac mae treialon clinigol sy'n defnyddio'r fectorau hynny ar gamau cynnydd gwahanol [17,300,301,304-306].

Tan yn ddiweddar, brechlynnau HIV-1 ac EBOV oedd y ddwy brif enghraifft o gymhwyso brechlynnau ar sail fector Ad, ond nid dyma'r unig rai. Mae gwahanol ymdrechion wedi'u gwneud i ddefnyddio fectorau brechlyn Ad yn erbyn pathogenau amrywiol megis Mycobacterium tuberculosis [307-310], firws dengue [311-313], hepatitis B ac C [314-320], y gynddaredd [321-324], neu ffliw [325–328]. Fodd bynnag, roedd eu heffeithiolrwydd bob amser yn is na'r disgwyl (am ragor o fanylion, gweler [18,142,300,329]). Mae ymgeisydd brechlyn EBOV wedi parhau i fod yr unig frechlyn Ad a gymhwysir yn ymarferol ac fe'i defnyddir gyda rhai cyfyngiadau yng Ngweriniaeth Ddemocrataidd y Congo. Mae'r brechlyn hwn yn seiliedig ar y math Ad26 (Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO), ac, ym mis Mai 2020, cafodd 20,339 o bobl y dos cyntaf o'r brechlyn, a chafodd 9560 eu brechu'n llawn [230,301,330].

Mae brechlynnau wedi'u fectoru gan adenofirws wedi cael hwb cyhoeddus mawr mewn ymateb i'r pandemig SARS-CoV-2. Mae brys y sefyllfa wedi ei gwneud hi'n bosibl manteisio ar eu datblygiad, gan gynnwys profiad a gafwyd gyda brechlynnau a godwyd yn erbyn coronafirysau a achosodd achosion blaenorol o SARS-CoV-1 a gyfyngwyd yn rhanbarthol [331]. Nodwyd glycoprotein pigyn coronafirws (S) fel yr antigen brechlyn gorau ar gyfer imiwnedd i heintiau coronafirws [332,333]. Hyd yn hyn, mae pedwar brechlyn fector Ad, pob un yn amgodio'r antigen pigyn, mewn cyflwr datblygedig ac wedi'u rhoi ar gyfer defnydd brys mewn rhannau helaeth o'r byd. Mae'r strategaethau fector cymhwysol wedi bod ychydig yn wahanol, ond yn eu hanfod maent yn cynnwys defnyddio fectorau cenhedlaeth gyntaf. Maent yn amrywio o ddefnyddio fectorau sy'n seiliedig ar rywogaethau C Ad (Ad5-nCoV), i oresgyn imiwnedd sy'n bodoli eisoes gyda dos fector uchel (CanSino) [187,334], i ddefnyddio firws D rhywogaeth llai cyffredin Ad26, gan ddefnyddio glycoprotein pigyn sefydlog (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) [335]. Mae dull amgen yn defnyddio ChAdOx1-S-(AZD1222), fector Hysbysebu o tsimpansî [336,337]. Mae'r unig frechlyn sy'n cael ei ddefnyddio yn seiliedig ar strategaeth hwb cysefin heterologaidd i oresgyn imiwnedd fector (Gam-COVIDVac/Sputnik V) yn cymhwyso fector sy'n seiliedig ar Ad yn gyntaf ac yna yn y pigiad atgyfnerthu yn defnyddio fector Ad5 [338,339]. Ym mhob achos, mae data treialon clinigol wedi bod yn addawol iawn, gan ddangos lefelau uchel o imiwnedd amddiffynnol ysgogedig, ac mae defnydd brys wedi'i ganiatáu mewn sawl gwlad ar gyfer defnyddio brechlynnau sy'n seiliedig ar Ad. At hynny, mae arolygon epidemiolegol o'r ymgyrchoedd brechu parhaus mewn gwahanol wledydd yn awgrymu llwyddiant ysgubol yn y defnydd o frechlynnau SARS-CoV-2 ar sail Ad.

4. Modiwleiddio Effeithlonrwydd Fector Adenovirws (Brechlyn), mae'r Capsid yn Arwain y Ffordd

Rhaid i ddyluniad fector adenovirws (brechlyn) ystyried sawl ffactor. Mae'r rhain yn cynnwys cynnal mynegiant hir a pharhaus o'r antigen wedi'i amgodio ac actifadu cyd-destun imiwnolegol (effaith gynorthwyol) sy'n caniatáu trosi mynegiant antigen yn effeithlon i imiwnedd addasol parhaus wedi'i gyfeirio yn erbyn yr imiwnogen ond nid yn erbyn y fector ei hun. Mae'r cyd-destun imiwnolegol yn cael ei ddarparu gan yr actifadu imiwnedd cynhenid ​​​​y mae fector y brechlyn yn ei ennyn wrth ei roi. Yn y cyd-destun hwn, mae'r effeithlonrwydd y mae synwyryddion imiwnedd cynhenid ​​​​yn canfod y fector yn bwysig, a byddant yn ei dro yn pennu osgled yr ymateb addasol. Fel y disgrifir yn yr adrannau uchod, mae synhwyro imiwnedd cynhenid ​​​​yn bennaf yn digwydd ar y lefel ôl-fynediad, yn cydredol â threiddiad endosome Ad. Mae mynegiant effeithlon yr antigen (brechlyn) yn dibynnu wedyn ar y cydbwysedd rhwng lefel clirio fector yn erbyn cyflwyno llwyddiannus a mynegiant genomau fector i'r niwclews. Gyda datblygiad fectorau arddangos capsid, nid oes angen mynegiant y transgene i ysgogi actifadu imiwnedd. Mae'r strategaeth hon yn seiliedig ar fewnosod epitope o ddiddordeb i broteinau Ad capsid, gan ganiatáu iddo ddod i gysylltiad uniongyrchol â'r system imiwnedd. Hyd yn oed os oes gan y dull hwn rai manteision, mae'r rhan fwyaf o fectorau brechlyn yn dibynnu ar enynnau wedi'u hamgodio'n enetig. Am ddarllen pellach ar fectorau arddangos capsid, gweler yr adolygiadau hyn, [340,341].

Gall imiwnedd sy'n bodoli eisoes yn erbyn fector firaol (ee, 30-90 y cant yn erbyn firws C rhywogaeth Ad5, yn dibynnu ar y lleoliad daearyddol) leihau cymeriant fector a lleihau'r mynegiant antigen a'r ymateb imiwn o ganlyniad [342-344]. Mae sawl strategaeth wedi'u datblygu i leihau imiwnedd gwrth-fector ac fe'u hadolygwyd yn ddiweddar [249]. Yn gryno, mae'r gwrthgyrff niwtraleiddio yn bennaf yn cydnabod dolen or-newidiol exons ac o ganlyniad maent yn seroteip-benodol [178-180]. Felly gall y dolenni gor-amrywiol hyn gael eu disodli gan rai seroteip arall, llai cyffredin [178,345]. Mae hyn yn atal y fector rhag cael ei niwtraleiddio a'i anactifadu. Gan mai Ad5 yw'r math mwyaf seroprevalent, byddai defnyddio seroteipiau prin fel Ad26, Ad35, neu Ads nad ydynt yn ddynol hefyd yn osgoi'r mater hwn [177,346-350].

Fodd bynnag, un o anfanteision mawr y defnydd o fathau prin yw eu llai o imiwnogenigrwydd sy'n eu gwneud yn llai effeithlon o ran datblygu brechlynnau [298]. Felly, dylid datblygu strategaethau i leihau imiwnedd gwrth-fector ochr yn ochr â strategaethau i wella imiwnogenedd fector i gael y fector mwyaf effeithlon. Hyd yn oed os yw lefel gychwynnol y gwrthgyrff niwtraleiddio yn erbyn y fector yn isel, gall brechu â math fector penodol ysgogi ymateb sy'n atal ei ddefnyddio yn y dyfodol. Mae preimio'r ymateb gwrth-fector hefyd yn digwydd ar y lefel ôl-fynediad, pan fydd gronynnau fector yn cael eu didoli a'u prosesu fel antigenau eu hunain. Gallai sicrhau cyd-destun imiwnolegol ffafriol ar gyfer llwyddiant brechu ddod ar draul cynyddu preimio ar gyfer imiwnedd fector. Gall deall y paramedrau sy'n pennu tynged fectorau Ad ar ôl eu derbyn fod yn gyfle i ddylunio fector.

4.1. Saif Sefydlogrwydd yn y Rhywogaeth

Mae derbyniad cyfryngol derbynnydd a dianc o'r adran endo-lysosomaidd yn nodweddion haint Ad a thrawsgludiad fector. Mae'r defnydd cychwynnol yn cael ei bennu gan ryngweithiad y ffibr firws a moleciwlau penton â derbynyddion celloedd. Mae ffibr a phenton yn gyffredin i bob Hysbyseb, ond, yn ôl eu rhywogaeth, maent yn ymgysylltu â gwahanol dderbynyddion cellog (Tabl 1). Mae firysau rhywogaeth C yn defnyddio CAR, ac mae gronynnau sy'n mynd i mewn yn dianc o adran endosomaidd gynnar [79]. Os yw firysau rhywogaeth C (Ad5) yn cael eu peiriannu i gynnwys moleciwl ffibr o firws rhywogaeth B (Ad16), mae'r gronyn canlyniadol (Ad5F16) yna'n dianc o adran lysosomaidd (fel y dangosir gan staenio â'r marciwr lysosomaidd LAMP1) yn lle'r rhan gynnar endosome [351]. Mae'r oedi hwn rhag dianc o lysosomau yn nodwedd a rennir gyda phob firws rhywogaeth B a brofwyd [111,352,353].

Ar ben hynny, mae'r hybrid Ad5F16 yn ogystal â firysau rhywogaeth B yn ennyn ymateb pro-llidiol cryfach na firysau rhywogaeth C [159,351]. Priodolir hyn i fwy o ganfod trwy TLR9 mewnluminol mewn celloedd imiwnedd [354]. Yn ogystal, mae difrod bilen lysosomaidd, yn wahanol i ddifrod endosome cynnar, yn achosi straen ocsideiddiol cryf. Mae rhwyg lysosome yn cyd-ryddhau hydrolasau lysosomaidd fel cathepsin B a all niweidio mitocondria, a thrwy hynny ymhelaethu ar yr ymateb difrod trwy actifadu llidus [355-357]. Mae'r broses derbyn Ad yn ansefydlogi'r capsid, gan ganiatáu rhyddhau'r protein firaol VI [103,106]. Yna mae protein VI a ryddhawyd yn treiddio i'r bilen o'r tu mewn i'r adran endo-lysosomaidd i ganiatáu i'r firws gael mynediad i'r sytosol. Mae cymharu rhywogaethau C a B yn dangos bod y ddau firws yr un mor effeithlon o ran mynediad cytosol a chyflwyno genom, ond yn wahanol yn eu cineteg dianc [111]. Mae'r ffaith y gall cyfnewid ffibr syml drosglwyddo'r mynediad a'r eiddo imiwnogenig o rywogaeth B i firws rhywogaeth C yn rhyfeddol. Mae'n darparu prawf o'r cysyniad y gellir dylunio fectorau hybrid sydd â phriodweddau penodol. Ymddengys mai'r gwahaniaeth sylfaenol yw bod oedi wrth ryddhau protein VI mewn firysau rhywogaeth B (neu'r firws hybrid) ac efallai y bydd angen asideiddio neu sbardun dadosod anhysbys arall.

Gan fod rhyddhau protein VI yn cael ei ohirio yn yr achos hwn, gallai hyn adlewyrchu mwy o sefydlogrwydd capsid. Yn wir, dangoswyd bod firysau rhywogaethau C Ad5 yn rhyddhau'r moleciwl ffibr wrth rwymo celloedd, cam y tybir ei fod yn gwanhau'r capsid ac yn cychwyn y broses ddadosod ar gyfer rhyddhau protein VI. Yn y cyd-destun hwn, dangoswyd bod Ad5 di-ffibr yn llai sefydlog na gronynnau brodorol [358]. Mewn cyferbyniad, nid yw Ts1 Ad2/5 hyper-sefydlog, anaeddfed yn rhyddhau ffibr neu brotein VI ac maent yn achosi llid gwael, gan nad ydynt yn sbarduno TLR9 nac yn achosi niwed i bilen [114,138,359,360].

Nid ydym wedi ymchwilio i weld a yw cyfnewid ffibr gyda rhywogaeth B yn atal rhyddhau ffibr cychwynnol ac yn gwneud y rhywogaeth C capsid yn fwy sefydlog, ond mae'n debygol. Gall sefydlogrwydd capsid fod yn benderfynydd hanfodol o dynged capsid ôl-fynediad a, thrwy estyniad, yn nodwedd y gellid ei hecsbloetio ar gyfer dylunio fector. Gall firysau Rhywogaeth B fod yn fwy sefydlog oherwydd y defnydd o dderbynnydd gwahanol neu trwy ryngweithio ffibr-penton unigryw. Mewn cyferbyniad, mae firysau rhywogaethau F Ad40/41 yn heintio'r llwybr gastroberfeddol ac wedi cynyddu sefydlogrwydd capsid oherwydd eu tropiaeth a'u haddasiad i amgylchedd llym y coludd [24,361]. Mae gan y perfedd dymheredd cynhenid ​​​​sydd ychydig raddau uwchlaw'r llwybr anadlol uchaf a dargedir gan firysau rhywogaeth C (37 ◦C vs. 33 ◦C) [362]. Felly, mae Ad40/41 yn eu hanfod yn fwy thermostable, gan gefnogi'r broses heintio [24], gan eu gwneud hefyd yn anodd eu lluosogi [24,361,363].

Yn ogystal, nid oes ganddynt motiff RGD yn y moleciwl penton, gan arwain at ostyngiad pellach mewn mynediad celloedd [92]. Ni wyddys a yw'r priodweddau capsid unigryw hyn yn trosi'n ddihangfa o adran lysosomaidd neu ddadgydosod rhannol / rhyddhau protein VI wrth ddod i mewn. Mewn cyferbyniad, gall y priodweddau hyn ddarparu cyd-destun ar gyfer datblygu cymwysiadau brechlynnau geneuol. Yn wahanol i ffibrau rhywogaethau B, mae gan fectorau sy'n cynnal ffibr rhywogaethau F lai o actifadu imiwnedd [364] o'u cymhwyso i amodau amgylcheddol safonol. Os yw rhywogaeth Ad ddynol benodol bellach yn cael ei thynnu allan o'i chyd-destun a'i defnyddio fel fector brechlyn, gallai fod yn werth edrych ar dropiaeth naturiol y fector hwn i chwilio am gliwiau i ragweld ei ymddygiad. Mae'r fector brechlyn a ddefnyddir ar hyn o bryd yn seiliedig ar Ad26 yn firws rhywogaeth D, a'i dropiaeth naturiol yw'r llygaid a'r llwybr gastroberfeddol [365]. Mae firysau Rhywogaethau D gan gynnwys Ad26 yn llai imiwnogenig nag Ad5 [366] ac fe'u dangoswyd i draffig i'r adran endosomaidd hwyr, yn ôl pob tebyg yn cynnwys oedi wrth ryddhau protein VI.

O ganlyniad, roedd blocio asideiddio'r adran endosomaidd hwyr yn lleihau ei imiwnogenigrwydd ymhellach [113]. Mewn cyferbyniad â Hysbysebion dynol, mae'r wybodaeth am Hysbysebion nad ydynt yn ddynol a ddefnyddir hefyd mewn brechu a fectoreiddio yn gyfyngedig iawn. Mae hysbysebion sy'n deillio o Tsimpansî gan gynnwys y ChAd3 yn perthyn yn agos i firysau rhywogaeth D [367,368]. Yn ddiddorol, mae fectorau Ad5 yn fwy imiwnogenig na fectorau Ad sy'n deillio o tsimpansî ac mae ganddyn nhw botensial trawsgludo uwch. Nid oedd yr arsylwad hwn yn gysylltiedig â gwahaniaethau yn y motiff penton RGD na'r ffibr, ac mae ei reswm mecanistig yn parhau i fod yn anhysbys [369]. Nid yw gwahaniaethau posibl mewn sefydlogrwydd capsid wedi'u hymchwilio. Ad nad yw'n ddynol arall sy'n cael ei ddefnyddio fel fector yw'r math Ad cwn 2 (CAV-2). Mae gan y fector hwn yr eiddo rhyfeddol i drawsgludo niwronau yn ddetholus, ond nid celloedd glial amgylchynol, yn wahanol i fector rheoli Ad5, er bod y ddau fector yn defnyddio'r un derbynnydd [370-372]. Gall y gallu hwn fod yn gysylltiedig â mwy o sefydlogrwydd capsid, gan ganiatáu dadorchuddio mewn celloedd niwronaidd yn unig. Mae tymheredd corff cŵn ~2 ◦C yn uwch na bodau dynol, a allai arwain at sefydlogrwydd capsid CAV uwch [373], sy'n cyfateb i firysau rhywogaeth F. Mae CAV-2 yn achosi ymateb imiwn cynhenid ​​​​yn wael, sy'n gyson â diffyg dadosod effeithlon mewn celloedd targed [372]. Felly, gallai fectorau CAV2 fod yn enghraifft arall lle mae gan briodwedd bioffisegol sy'n gysylltiedig â'i dropiaeth naturiol neu ei letywr y potensial i ddarparu priodweddau fector newydd.

4.2. Cywiro'r Strwythur Capsid, yr Enghraifft o Brotein VI mewn Rhywogaeth C Ad2/5

Os yw sefydlogrwydd capsid a rhyddhau protein VI yn pennu tynged y capsid firaol i lawr yr afon, mae'r cwestiwn yn codi a ellir addasu hyn mewn fectorau Ad, hy, i briodoli priodweddau newydd i fectorau firaol (Ffigur 3). Daw'r rhan fwyaf o'n dealltwriaeth o sut mae Hysbysebion yn treiddio i'r adran endo-lysosomaidd o'r rhywogaeth C firysau Ad2/5. Roedd darganfod protein VI fel ffactor lytig bilen yn hanfodol i ddeall y broses hon [103,106]. Mae Protein VI yn amgodio helics amffipathig N-terminal sef rhan lytig bilen gwirioneddol y protein. Yn ystod cynhyrchu firws, mynegir protein VI fel protein rhagflaenydd sy'n cysylltu â thriwyr hecson trwy'r helics amffipathig [42,374]. Mae'r cyfadeilad yn cael ei fewnforio i'r cnewyllyn trwy signalau trafnidiaeth wedi'u hamgodio yn y terminws N- a C o brotein VI, sy'n cael eu tynnu yn ystod cydosod firws ac aeddfedu gan y proteas firaol. Mae'r peptid asid amino C-terminal 11 hefyd yn actifadu'r proteas, gan ddarparu ffordd graff o gysylltu cydosod firws â gwarchod yr helics amffipathig. Mae gan firws mutant Ts1 Ad2/5 ddiffyg pecynnu ar gyfer y proteas, ac nid yw'r un o'r proteinau capsid, gan gynnwys protein VI, yn cael ei brosesu. Mae'r gronynnau canlyniadol yn or-sefydlog, yn cadw ffibrau, ac nid ydynt yn defnyddio protein VI.

O ganlyniad, mae gronynnau Ts1 yn cael eu didoli yn lysosomau ar endocytosis trwy gyfrwng derbynnydd. Nid yw union leoliad protein VI yn y firws aeddfed yn glir, ond mae'r terminws N holltedig yn lleoleiddio i wyneb hecson mewnol exons peripersonol [37,104,375]. Dangoswyd bod treigladau dau bwynt mewn protein VI, G33A, a S28C, yn cynyddu sefydlogrwydd capsid Ad5 (Ffigur 3A) [376,377]. Mae'r mutant cyntaf yn rhagflaenu'r safle holltiad proteas N-terminal mewn protein VI ac yn amharu ar y prosesu. Mae'r gronynnau sy'n deillio o hyn yn rhannol anaeddfed ac fe'u nodweddir gan ddiffyg lysis endosome, sy'n awgrymu bod N-terminus protein VI yn sefydlogi rhyngweithiadau protein-protein intravirion [376]. Dewiswyd yr ail mutant oherwydd ei allu i ffurfio pontydd disulfide rhyng-foleciwlaidd [377].

Roedd y firws yn cynnwys proteinau rhannol heb eu prosesu, gan gynnwys protein VII o bosibl, ond yn syndod ni ddangosodd unrhyw ddiffygion heintio, er gwaethaf ei sefydlogrwydd cynyddol. Ni wyddys a oes gan y naill firws neu'r llall broffil actifadu imiwnedd wedi'i newid. Treiglad pwynt arall mewn protein VI sy'n effeithio ar dynged y firws yw'r mwtaniad protein VI L40Q, sydd wedi'i leoli'n uniongyrchol yn yr helics amffipathig (Ffigur 3A) [378,379]. Mae firysau gyda'r treiglad hwn yn aeddfedu'n normal ond maent yn rhannol ddiffygiol ar gyfer y cam lysis endosome. Mewn cyferbyniad â'r mutants uchod, mae virions L40Q yn llai sefydlog na'u cymheiriaid gwyllt. Yn lle oedi, mae protein VI yn ogystal â phenton yn cael eu rhyddhau'n gynamserol o'r capsid L40Q. Mae virions L40Q yn llai heintus ac yn destun didoli rhannol lysosom. Fodd bynnag, nid yw'r treiglad L40Q yn diddymu'r lysis bilen yn llwyr, ac mae rhai firysau'n dianc i'r cytosol, gan arwain at heintiad llai o fector L40Q [379,380] yn gyffredinol bedair gwaith yn fwy [379,380]. Mae'r arsylwadau yn awgrymu bod yr helics amffipathig yn cyfrannu at ei ryngweithio i sefydlogrwydd y gronynnau. Nid yw'n hysbys os a sut mae'r treiglad L40Q yn newid priodwedd imiwnogenig fectorau Ad5. Mae arsylwadau diweddar yn awgrymu bod rhyddhau protein VI o'r capsid yn cael ei sbarduno gan gystadleuaeth fewnol â phrotein VII ar gyfer yr un safleoedd rhwymo neu orgyffwrdd mewn exons [375].

Yn gyson, mae firws mutant heb brotein VII yn methu â dianc o'r endosome ac mae ganddo ddiffyg mewn lysis endosome [58]. Bydd dealltwriaeth bellach o drefniadaeth strwythurol a deinamig y capsid mewnol (hy, protein VI) a phroteinau craidd (hy, protein V a VII) yn y gronyn ac yn ystod y gell, mynediad yn help mawr i ddeall beth sy'n pennu sefydlogrwydd capsid (cildroadwy).

Mae rheoli effeithlonrwydd actifadu imiwnedd fectorau Ad yn ddiddordeb mawr ar gyfer datblygu brechlynnau, a byddai ehangu cyflwyniad MHC o antigenau yn gwella datblygiad brechlynnau [381]. Fel y soniwyd yn flaenorol, mae awtoffagy yn rheoleiddio actifadu imiwnedd ac yn bwydo peptidau i'r MHC. Autophagy yw un o'r mecanweithiau amddiffyn cellog hynaf yn erbyn haint, ac eto nid yw Hysbysebion, fel pathogenau dynol wedi'u haddasu, wedi datblygu mecanweithiau i osgoi awtophagi wrth fynd i mewn. Yn lle hynny, mae'n ymddangos eu bod yn croesawu actifadu awtophagi ac yn dargyfeirio'r cyfrifoldeb i hyrwyddo haint. Mae Protein VI yn chwarae rhan ganolog wrth reoli ymateb awtophagig y gell. Mae lysis pilen adenovirws gan brotein VI yn arwain at recriwtio galectin 3 a galectin 8, sy'n cael eu cydnabod gan y gell fel signalau perygl (Ffigur 3B) [108,109,382]. Mae canfod safleoedd treiddiad Ad gan galectinau yn actifadu awtophagi dethol yn y gell heintiedig, fel y dangosir gan recriwtio derbynyddion awtoffagy (ee, NDP52 ap62) a ffurfiant punctae LC3 [108].

Yn ddiddorol, mae gronynnau fector Ad5 yn llwyddo i ddianc o'r endosom rhwygo a gallant draffig i'r cnewyllyn. Nid yw atal awtoffagy yn effeithio ar heintiad firaol, ond mae'n gohirio eu danfoniad genom i'r cnewyllyn, gan ddangos bod Ads yn herwgipio'r peiriannau cellog am eu helw [108]. Mae dianc o'r endosome, felly, yn caniatáu i'r firws osgoi diraddio gan awtophagi trwy broses weithredol. Darganfuwyd y broses hon gan mutant protein VI arall, y mutant M1. Mae pob hysbyseb dynol (a sawl hysbyseb nad yw'n ddynol) yn amgodio motiff peptid PPxY sydd wedi'i gadw'n helaeth ym mhrotein VI. Yn y mutant M1, newidiwyd y motiff hwn i PGAA (Ffigur 3) [104]. Mae'r math gwyllt a'r mutant M1 yn rhyddhau protein VI yn effeithlon wrth ddod i mewn ac yn sbarduno awtophagi ar ôl i'r bilen endosomaidd rwygo. Fodd bynnag, nid yw'r firws mutant M1 yn gallu dianc yn effeithlon i'r sytosol, ac mae delweddau EM wedi dangos bod firysau mutant M1 yn cael eu dal mewn endosomau rhwygo, wedi'u targedu gan awtophagi.

O ganlyniad, dangoswyd bod gan firws mutant M1 nam heintus cryf, sy'n cael ei adfer ar ataliad ffarmacolegol a genetig awtophag. Dangosodd yr astudiaeth fod firysau tebyg i wyllt yn defnyddio eu motiff PPxY i recriwtio'r ligas ubiquitin NEDD4.2 a chyfyngu ar aeddfedu awtoffagosomau yn ddigon hir i ddianc i'r cytosol. Ar ben hynny, mae'r eiddo hwn yn caniatáu i'r firws gyfyngu ar ei gyflwyniad antigenig [108]. Yn bwysig iawn, arweiniodd y fector mutant M1 a chwistrellwyd i lygod at imiwnedd gwrth-fector llawer cryfach ac ymateb CD8 a mwy llai i'r trawsgenyn wedi'i amgodio, gan ddangos y gall newid capsid syml gael effaith ddwys ar imiwnogenigrwydd capsid Ad5. Ni wyddys a oes unrhyw un o'r treigladau protein VI eraill sy'n effeithio ar imiwnogenedd. Fodd bynnag, gall presenoldeb y motiff PPxY yn y firws L40Q esbonio pam mae'r fector yn cadw heintiad cymharol uchel er gwaethaf y diffyg lysis bilen [379,380]. Oherwydd bod y lysis endosome yn llai effeithlon, a bod fectorau L40Q yn y pen draw yn rhannol yn y compartment lysosomaidd, mae'n bosibl bod yr ymateb imiwn a godir eto'n wahanol i gapsidau math gwyllt, Ts1, neu M1 Ad5.